Identificación, caracterización y verificación de las proteínas 130 y 131 como 14-3-3
Figura 1.
Figura 1. Regiones de los geles teñidos de plata que muestran las manchas de proteínas 130 y 131 tras la electroforesis bidimensional.
El panel A muestra líquido cefalorraquídeo normal, con las manchas 130 y 131 ausentes. El panel B muestra líquido cefalorraquídeo de un paciente con la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob; las flechas señalan las manchas 130 y 131. Los geles de los paneles C y D son de un extracto de cerebro humano normal. Los paneles A, B y C muestran la misma región de gel, con puntos isoeléctricos que van de 4,8 a 6,0 (de izquierda a derecha) en el eje x, y tamaños que van de 10 a 40 kd (de abajo a arriba) en el eje y. El recuadro punteado del panel C delimita la región mostrada en el panel D de un gel con un rango de pH de 4,5 a 5,4. Las flechas en los paneles B y C indican la ubicación de los puntos 130 y 131, que están etiquetados en el panel D.
Los resultados de la electroforesis bidimensional para la detección de las proteínas 130 y 131 del líquido cefalorraquídeo en pacientes con la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob se muestran en la Figura 1A y la Figura 1B. Las recientes mejoras técnicas han permitido aumentar la resolución, con seis manchas en lugar de las dos (correspondientes a las proteínas 130 y 131) descritas originalmente. Con el fin de encontrar una fuente abundante de estas proteínas, examinamos el tejido cerebral normal para determinar si alguna proteína cerebral se encuentra cerca de la constelación de manchas correspondientes a las proteínas 130 y 131 del líquido cefalorraquídeo. La Figura 1C muestra una región de un gel teñido de plata tras la electroforesis bidimensional de proteínas cerebrales normales. Varias de las proteínas aparecen en la misma zona que la constelación 130-131, incluyendo dos que tienen la misma carga y masa que la constelación 130-131 del líquido cefalorraquídeo. La identificación de las dos manchas sobre la base de su posición fue confirmada por estudios de comigración. La mancha 130 se purificó mediante electroforesis bidimensional de rango estrecho (rango de pH, 4,5 a 5,4), como se muestra en la Figura 1D.
La mancha 130 se extrajo de 10 blots, se digirió enzimáticamente y se realizó una microsecuencia. Se obtuvieron secuencias de aminoácidos de cuatro fragmentos peptídicos. Tres de estas secuencias, Val-Thr-Glu-Leu-Asn-Glu-Pro-Leu-Xaa-Asn-Glu-Asp-Xaa-Asn-Leu-Leu-Ser-Val-Ala, Asp-Tyr-Tyr-Xaa-Tyr-Leu-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Gly-Glu-Lys, y Asn-Val-Val-Xaa-Ala-Arg-Arg-Ser-Ser-Xaa-Arg-Val-Ile-Ser-Ile-Glu-Gln, coincidían con la secuencia de la proteína humana 14-3-3, isoforma eta. La cuarta secuencia, Tyr-Ser-Glu-Ala-Xaa-Glu-Ile-Ser, coincidía con la proteína 14-3-3 bovina, isoforma gamma.
El anticuerpo 14-3-3 reaccionó específicamente con las proteínas 130 y 131 del líquido cefalorraquídeo en un inmunoblot electroforético bidimensional pero no reaccionó con otras proteínas del líquido cefalorraquídeo, verificando así que las proteínas 130 y 131 del líquido cefalorraquídeo son proteínas 14-3-3.
Inmunoensayo 14-3-3
Figura 2.
Figura 2. Inmunotinción para el anticuerpo policlonal de conejo anti-14-3-3β después de la electroforesis de gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio.
El carril 1 muestra líquido cefalorraquídeo de un paciente con evidencia patológica de enfermedad de Alzheimer, los carriles 2 y 3 muestran líquido cefalorraquídeo de dos pacientes con enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, el carril 4 muestra líquido cefalorraquídeo de una vaca normal, el carril 5 muestra líquido cefalorraquídeo de una vaca con encefalopatía transmisible de visón inducida experimentalmente y evidencia patológica de enfermedad espongiforme, el carril 6 muestra suero humano normal, el carril 7 muestra suero de un paciente con enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, el carril 8 muestra un extracto de cerebro humano normal, y el carril 9 muestra proteína priónica purificada del cerebro de un paciente con enfermedad de Creutzfeldt-Jakob.
El descubrimiento de que las manchas 30-kd del líquido cefalorraquídeo (proteínas 130 y 131) son proteínas 14-3-3 condujo al desarrollo de un sencillo inmunoensayo para ayudar al diagnóstico de la encefalopatía espongiforme transmisible. Como muestra la Figura 2, en el líquido cefalorraquídeo de los pacientes con la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob había una banda inmunorreactiva de 30-kd (carriles 2 y 3), mientras que no se detectó ninguna banda de este tipo en el líquido cefalorraquídeo de los controles sanos (datos no mostrados) o de un paciente con la enfermedad de Alzheimer (carril 1). Como se esperaba, la proteína 14-3-3 era abundante en un extracto de cerebro humano normal (carril 8). la proteína 14-3-3 no se encontró en el suero normal (carril 6); sin embargo, tampoco se detectó en el suero de pacientes con la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (carril 7). La proteína priónica purificada del cerebro de un paciente con la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (carril 9) no reaccionó de forma cruzada con el anticuerpo 14-3-3, confirmando que 14-3-3 no es una proteína priónica.
Tabla 1.
Tabla 1. Muestras de líquido cefalorraquídeo evaluadas con el inmunoensayo 14-3-3, según el diagnóstico. Tabla 2.
Tabla 2. Sensibilidad y especificidad del inmunoensayo 14-3-3 para la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob.
Sesenta y ocho de 71 muestras de líquido cefalorraquídeo de pacientes con la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (96 por ciento) fueron positivas para 14-3-3 (Tabla 1 y Tabla 2). Cuatro de 94 muestras (4 por ciento) de pacientes con otras enfermedades que implican demencia fueron positivas para 14-3-3 (Tabla 1 y Tabla 2) (P<0,001). Además, cuando se excluyeron del análisis los pacientes con demencia que se sabía que habían tenido infartos cerebrales agudos dentro del mes anterior a la prueba, sólo 1 de 91 muestras (1 por ciento) fue positiva (P<0,001). Las muestras de los 10 pacientes con demencia multiinfarto pero sin accidentes cerebrovasculares en el mes anterior a la prueba fueron negativas para 14-3-3. El único resultado falso positivo entre las muestras de líquido cefalorraquídeo de los demás pacientes con demencia procedía de un paciente con un diagnóstico clínico de enfermedad de Alzheimer que no había sido verificado por estudios patológicos.
El 14-3-3 se detectó en 18 de las 66 muestras de líquido cefalorraquídeo (27 por ciento) de pacientes con otras enfermedades neurológicas no relacionadas con la demencia. Las 18 muestras positivas procedían de pacientes con encefalitis vírica aguda, accidente cerebrovascular (sin demencia) en el plazo de un mes antes de la prueba, hemorragia subaracnoidea o síndrome de Rett. La enfermedad de Creutzfeldt-Jakob no podía incluirse razonablemente en el diagnóstico diferencial de ninguno de estos trastornos.
En general, la sensibilidad del inmunoensayo 14-3-3 como marcador de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob fue del 96 por ciento (68 resultados positivos verdaderos divididos por 71 resultados positivos verdaderos y falsos negativos; intervalo de confianza del 95 por ciento, 92 a 99 por ciento), y la especificidad fue del 88 por ciento (164 resultados negativos verdaderos divididos por 186 resultados negativos verdaderos y falsos positivos; intervalo de confianza del 95 por ciento, 84 a 92 por ciento). Más importante aún, la especificidad de este ensayo entre todos los pacientes con demencia fue del 96 por ciento (90 resultados negativos verdaderos divididos por 94 resultados negativos verdaderos y falsos positivos; intervalo de confianza del 95 por ciento, 90 a 96 por ciento), y cuando se excluyeron los tres pacientes con demencia e infarto cerebral en el plazo de un mes antes de la prueba, la especificidad del inmunoensayo fue del 99 por ciento (90 resultados negativos verdaderos divididos por 91 resultados negativos verdaderos y falsos positivos; intervalo de confianza del 95 por ciento, 97 a 100 por ciento) (Tabla 1 y Tabla 2).
Comparación de la electroforesis bidimensional y el inmunoensayo
Tabla 3.
Tabla 3. Comparación de la electroforesis bidimensional para las proteínas 130 y 131 y el inmunoensayo 14-3-3.
Se comparó el ensayo electroforético bidimensional para las proteínas 130 y 131 con el inmunoensayo 14-3-3 en 50 muestras de líquido cefalorraquídeo (Tabla 3). Trece de 15 muestras de pacientes con la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob fueron positivas con ambas pruebas, y las otras 2 muestras fueron negativas para las proteínas 130 y 131 pero positivas para la proteína 14-3-3. Los resultados de las dos pruebas fueron iguales en muestras de pacientes con demencias no asociadas a la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob u otros trastornos neurológicos. Aunque las especificidades de las dos pruebas son similares, el inmunoensayo 14-3-3 tiene una sensibilidad ligeramente superior.
Inmunoensayo 14-3-3 en animales
Tabla 4.
Tabla 4. Resultados del inmunoensayo 14-3-3 en muestras de líquido cefalorraquídeo de animales.
Los resultados de los estudios en animales fueron consistentes con los de los estudios en humanos. La figura 2 muestra los resultados del ensayo en líquido cefalorraquídeo de una vaca normal (carril 4) y de una vaca con evidencia patológica de encefalopatía espongiforme transmisible (carril 5). Como muestra la Tabla 4, se detectó la proteína 14-3-3 en el líquido cefalorraquídeo de seis de los nueve bovinos con encefalopatía transmisible de visón o scrapie inducidos experimentalmente. La única vaca con características clínicas pero sin evidencia patológica de encefalopatía espongiforme transmisible también tuvo una prueba positiva. Ningún ganado de control tuvo pruebas positivas. La prueba fue positiva en cinco de las seis ovejas con tembladera adquirida naturalmente y fue negativa en la única oveja de control. Los 15 chimpancés infectados experimentalmente tuvieron pruebas positivas, mientras que ninguno de los 77 chimpancés de control las tuvo. La sensibilidad global del inmunoensayo 14-3-3 en animales fue del 87 por ciento, y la especificidad global del 99 por ciento.