- Los sistemas de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem cuádruple
- Desarrollo del método de extracción en fase sólida
- La estabilidad del diazepam y del nordiazepam en muestras acuosas ácidas y neutras
- Las recuperaciones de la extracción en fase sólida para muestras de agua ambiental simuladas, almacenadas a pH bajo de la muestra
- Regeneración del nordiazepam durante la preparación de la muestra
- Validación del método
- Cuantificación de diazepam y nordiazepam en muestras de agua ambiental
Los sistemas de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem cuádruple
Los sistemas de elución isocrática desarrollados, así como los de elución en gradiente, dieron una buena resolución de los picos (Rs ≥ 3,1) para el diazepam y el nordiazepam. En el sistema isocrático, los tiempos de retención fueron de 2,6 min (0,54 RSD %) y 4,1 min (0,27 RSD %) para los estándares de nordiazepam-d5 y diazepam-d5, respectivamente. En la matriz de agua superficial, los tiempos de retención fueron los mismos que para los estándares y los valores de RSD fueron de 0,62% y 0,30% para nordiazepam-d5 y diazepam-d5, respectivamente. Los tiempos de retención para los estándares de trabajo en el sistema de gradiente fueron de 2,4 min (0,90 % de RSD) y 2,9 min (0,70 % de RSD) para el nordiazepam y el diazepam, respectivamente. La precisión de los tiempos de retención de los compuestos en las aguas residuales tratadas se indica en la Tabla 1, donde los valores de RSD fueron ≤ 0,35%.
El diazepam y el nordiazepam se identificaron en las muestras de aguas residuales tratadas por sus transiciones MS/MS y tiempos de retención característicos (Tabla 1). Para cada compuesto se monitorizó un ion precursor y dos iones de fragmento. Para la identificación del diazepam y el nordiazepam «naturales», se compararon las proporciones de las áreas de los picos obtenidas de los dos iones de fragmentos con las de los estándares (Tabla 1). También se compararon los tiempos de retención de los compuestos objetivo con los tiempos de retención del diazepam-d5 y del nordiazepam-d5 en la misma corrida cromatográfica.
Desarrollo del método de extracción en fase sólida
La estabilidad del diazepam y del nordiazepam en muestras acuosas ácidas y neutras
Las muestras de agua ambiental recolectadas se almacenan comúnmente a pH ácido antes de analizar los contaminantes emergentes . En el presente estudio, se estudió la estabilidad del diazepam y el nordiazepam cuando se almacenan como estándares de trabajo (a pH 3,1 y pH 7,0). Se comprobó que el nordiazepam se degradaba mucho cuando se almacenaba en la solución ácida a temperatura ambiente. En 12 días, el 56% del nordiazepam se degradó (Fig. 2). La degradación no fue tan extensa cuando la solución de trabajo se almacenó a 4 °C; después de 12 días, se había degradado el 20% de la concentración inicial de nordiazepam. Por otro lado, el diazepam resultó ser estable a pH 3,1 cuando se almacenó a temperatura ambiente y a 4 °C (Fig. 2). En los 12 días, sólo el 0,53% y el 3,1% del diazepam se degradaron a temperatura ambiente y a 4 °C, respectivamente. Ambos compuestos se mostraron estables durante 12 días a pH neutro. En el día 12, las respuestas para el diazepam y el nordiazepam (cuando se almacenaron a 4 °C y a temperatura ambiente) fueron del 101-103% de las respuestas iniciales. Los valores de RSD (n = 3) para la concentración determinada en diferentes puntos temporales fueron ≤ 5,1%. La reacción se descubrió inicialmente en muestras de aguas residuales, pero los experimentos se realizaron en soluciones preparadas para simplificar las condiciones y reducir la posibilidad de otras reacciones/efectos en las matrices muy complejas de las aguas residuales.
La estabilidad del diazepam y el nordiazepam en ácido fórmico 5 mM en agua purificada, pH 3. Diazepam almacenado a 4 °C (triángulo blanco) y a temperatura ambiente (triángulo negro). Nordiazepam almacenado a 4 °C (cuadrado blanco) y a temperatura ambiente (cuadrado negro). Los detalles experimentales se describen en «Estudios de estabilidad del diazepam y el nordiazepam en soluciones acuosas ácidas y neutras»
Nuestros resultados muestran que el nordiazepam es inestable a pH 3, estos resultados están de acuerdo con los resultados de la literatura que muestran que el nordiazepam sufre hidrólisis en soluciones ácidas. Archontaki et al. descubrieron que el nordiazepam se hidrolizaba en soluciones acuosas ácidas y que el primer paso de la degradación era reversible. Sin embargo, los hallazgos del presente estudio pueden parecer contrarios a los resultados de un estudio reciente en el que se descubrió que el nordiazepam (y el diazepam) eran más estables a pH 2 que a pH 7 . En realidad, la diferencia es esperable si se tienen en cuenta las diferentes estrategias para la determinación de la recuperación. Dado que la transformación del nordiazepam se invierte durante la evaporación y el calentamiento, podría no haber ninguna implicación práctica para el uso rutinario del método. Sólo cuando se estima la recuperación según las recomendaciones de Matuszewski et al. en combinación con la inestabilidad del nordiazepam a pH bajo, se obtiene una pérdida del compuesto y, por tanto, una recuperación aparentemente alta.
Las recuperaciones de la extracción en fase sólida para muestras de agua ambiental simuladas, almacenadas a pH bajo de la muestra
Las recuperaciones de la extracción en fase sólida y el efecto de la matriz se determinaron en muestras de agua tratada por LC-MS utilizando el enfoque sugerido por Matuszewski et al. , los detalles se dan en «Validación del método». Las recuperaciones de extracción se determinaron para los estándares marcados con isótopos, diazepam-d5 y nordiazepam-d5, ya que no se espera que los compuestos marcados se encuentren en las matrices ambientales. En el presente estudio, los estándares de trabajo de diazepam-d5 y nordiazepam-d5 se almacenaron en ácido fórmico 5 mM en agua purificada pH 3,1/acetonitrilo (90/10, v/v), durante no más de 1 semana a 8 °C, y se utilizaron para preparar los conjuntos A-C.
Las recuperaciones relativas de la extracción, determinadas a una concentración baja y otra alta, se indican en la Tabla 2 (el método de extracción se indica en «Preparación de la muestra y extracción en fase sólida»). Las recuperaciones de extracción fueron mayores para el nordiazepam-d5 que para el diazepam-d5. Para el nordiazepam-d5, las recuperaciones de extracción relativas fueron de 114 ± 8,1% y 117 ± 21% en la concentración baja y alta, respectivamente. Los valores de RSD obtenidos para el diazepam-d5 fueron del 6,0% y del 24% para la concentración baja y alta, respectivamente (Tabla 2). A veces se obtienen altos valores de RSD (≥ 18%) para el procedimiento de extracción en fase sólida en determinaciones a nivel de trazas en matrices complejas . Además, en la literatura se han reportado previamente altas recuperaciones de extracción (≥ 100%) para nordiazepam en muestras de agua ambiental . Como se discutirá más adelante, las altas recuperaciones podrían estar correlacionadas con un equilibrio químico entre el nordiazepam y un producto de transformación.
La recuperación absoluta de la extracción de nordiazepam-d5 se determinó en 139 ± 21% y el efecto de matriz en 119 ± 3,0%. La alta recuperación de extracción absoluta para el nordiazepam-d5 puede explicarse en parte por el hecho de que el nordiazepam-d5 fue sometido a un aumento de iones en la interfaz de la EM. Sin embargo, demostramos que las altas recuperaciones de extracción (> 100% para la extracción relativa, como se ha comentado anteriormente) no se debían únicamente a los efectos de la matriz en la fuente ESI. Esto se determinó mediante las recuperaciones de extracción relativas obtenidas según Matuszewski et al. cuando las muestras extraídas y no extraídas se inyectaron en el sistema LC-MS/MS disueltas en la misma matriz. Además, para verificar aún más que las altas recuperaciones de extracción no estaban correlacionadas con ningún proceso en la interfaz del espectrómetro de masas, se determinaron las recuperaciones de extracción para el diazepam-d5 y el nordiazepam-d5 mediante el uso de una segunda técnica de detección, la LC-UV. La recuperación de una muestra extraída de nordiazepam-d5 en tampón fosfato (pH 7,0) analizada tanto con LC-MS/MS como con LC-UV se determinó que era de 159 y 153% (n = 2), respectivamente. Llegamos a la conclusión de que las altas recuperaciones de extracción para el nordiazepam no se atribuyeron, en gran medida, a ningún proceso en el espectrómetro de masas.
En conclusión, aunque las recuperaciones de extracción obtenidas y los valores de RSD fueron altos, probablemente parezcan razonables ya que las concentraciones de los compuestos objetivo fueron bajas (50 y 250 pM) y porque los compuestos se extrajeron de una matriz compleja. En este estudio, hemos querido demostrar que estas altas recuperaciones obtenidas para el nordiazepam podrían correlacionarse con un equilibrio químico entre el nordiazepam y un producto de transformación encontrado por Archontaki et al. .
Regeneración del nordiazepam durante la preparación de la muestra
Cuando las soluciones almacenadas de diazepam y nordiazepam (pH 3.1, a temperatura ambiente, «La estabilidad del diazepam y el nordiazepam en muestras acuosas ácidas y neutras») se utilizaron para espigar el tampón de fosfato y luego se sometieron a la extracción en fase sólida, las respuestas obtenidas de los extractos reconstituidos de nordiazepam fueron mayores en comparación con las respuestas obtenidas de las soluciones almacenadas sin extraer. Con la extracción en fase sólida, el área del pico de nordiazepam había aumentado de 26 recuentos de área (2,7 RSD %, n = 3) a 45 recuentos de área (14,6 RSD %, n = 3).
Para verificar que el nordiazepam se regeneró durante la extracción en fase sólida, se inyectaron en el sistema LC-MS/MS una muestra almacenada de nordiazepam-d5 (que dio un área de pico de 1470 para el ion fragmento de m/z 213) y una muestra procesada de nordiazepam-d5 (con un área de pico de 1790). Además del canal SRM de nordiazepam-d5 (276 → 213), se adquirieron dos canales SRM adicionales, Tabla 1. Se inyectaron las muestras almacenadas de nordiazepam-d5 (n = 6) y se determinó que las relaciones de las transiciones SRM eran de 1,4 (3,8 RSD %, relación de iones fragmento de m/z (276 → 213)/(276 → 165) y 1,0 (3,5 RSD %, relación de iones fragmento de m/z (276 → 213)/(276 → 140). Para la muestra procesada de nordiazepam-d5, las relaciones de las transiciones SRM fueron las mismas, es decir, 1,4 y 1,0. Por lo tanto, no hubo diferencias significativas en las relaciones de iones de fragmentos entre las muestras almacenadas y las procesadas. Además, los tiempos de retención eran los mismos para ambas muestras. Se llegó a la conclusión de que era el nordiazepam-d5 el que se detectaba tanto en las muestras almacenadas como en las procesadas.
Archontaki et al. descubrieron que el nordiazepam se transformaba en una solución acuosa ácida, en el producto intermedio N-(2-benzoil-4-clorofenil)-2-aminoacetamida con la fórmula molecular C15H13N2O2Cl y la masa monoisotópica 288,1 Da. El producto de transformación se cristalizó y se analizó por LC-UV, GC-MS, 1H- y 13C-NMR, y espectroscopia IR. El equilibrio químico entre el intermedio y el nordiazepam era reversible, pero la transformación posterior del intermedio en el producto de degradación final (C13H10NOCl) no era reversible. En el presente estudio, se detectó por LC-MS un ion con un tiempo de retención de 3,0 minutos y una relación masa-carga de 289,0 en una solución almacenada (pH 3,1) de nordiazepam. Este ion podría corresponder al + del producto de transformación del nordiazepam. Además, el patrón isotópico del ion a los 3,0 minutos se correspondía con el patrón isotópico de un átomo de cloro. Además, el pico cromatográfico eluyó antes que el nordiazepam, lo que concuerda con los resultados de las separaciones de nordiazepam y N-(2-benzoil-4-clorofenil)-2-aminoacetamida en el sistema de fase inversa utilizado por Archontaki et al. Así, el pico detectado en la solución de agua ácida almacenada, en este estudio, era muy probablemente N-(2-benzoil-4-clorofenil)-2-aminoacetamida. Además, la relación de área de pico del nordiazepam con la N-(2-benzoil-4-clorofenil)-2-aminoacetamida fue de 0,75 (n = 2) en esta solución de agua almacenada en el estudio presentado. En las mezclas de metanol evaporado (los detalles experimentales se describen en «Estudios de estabilidad del diazepam y del nordiazepam en soluciones acuosas ácidas y neutras»), la relación del área de pico del nordiazepam con la N-(2-benzoil-4-clorofenil)-2-aminoacetamida aumentó, sin embargo, a 1,9 (6,8 RSD %, n = 4), es decir el área del pico de nordiazepam aumentó y el área del pico de N-(2-benzoil-4-clorofenil)-2-aminoacetamida disminuyó en comparación con la muestra que no se evaporó. No se detectaron picos de N-(2-benzoil-4-clorofenil)-2-aminoacetamida ni de nordiazepam en la muestra en blanco. Estos resultados sugieren fuertemente que el equilibrio químico del nordiazepam y el producto de transformación del nordiazepam, caracterizado por Archontaki et al. se desplazó de la N-(2-benzoil-4-clorofenil)-2-aminoacetamida para formar nordiazepam durante la evaporación de los extractos SPE. No se detectó ningún pico que pudiera correlacionarse con el producto de degradación final (C13H10NOCl) del nordiazepam.
Se concluyó que el nordiazepam se transformaba fácilmente en N-(2-benzoil-4-clorofenil)-2-aminoacetamida en la solución acuosa ácida. Curiosamente, el nordiazepam se regeneró durante el proceso de extracción en fase sólida. Por lo tanto, al utilizar las soluciones almacenadas de nordiazepam a pH 3,0 como referencia en los cálculos de las recuperaciones de la extracción, se sobrestiman las recuperaciones de la extracción. Estos resultados son importantes durante la validación del método, es decir, durante la evaluación de las condiciones de almacenamiento, las recuperaciones de extracción y los efectos de la matriz. Además, la transformación del nordiazepam puede influir en los resultados analíticos generales si no se utiliza un análogo del nordiazepam marcado con isótopos como estándar interno. También hay que destacar que la transformación del nordiazepam podría influir en la precisión del método, no sólo durante el almacenamiento previo a la extracción en fase sólida, sino también en función del pH de la solución utilizada, por ejemplo, la reconstitución de los extractos SPE secos.
Validación del método
El método desarrollado se validó mediante el uso de los análogos marcados con isótopos, diazepam-d5 y nordiazepam-d5 («Validación del método»), ya que estos compuestos no se detectaron en las muestras ambientales. La ventaja de utilizar los análogos marcados para la validación del método es que éste puede validarse a niveles de trazas en la matriz real en la que se cuantifican los analitos. Las recuperaciones relativas de extracción en las muestras de aguas residuales tratadas fueron ≥ 87% para el diazepam-d5 y el nordiazepam-d5 en la concentración alta y baja (Tabla 3). Los valores obtenidos están en los rangos de lo que se puede esperar cuando se extraen concentraciones de nivel de trazas de productos farmacéuticos de matrices complejas . Las recuperaciones absolutas de la extracción fueron menores, entre el 63 y el 86%, ya que los analitos fueron sometidos a supresión iónica (Tabla 3). A baja concentración, los efectos de la matriz (ME %) fueron del 76 ± 14% y del 88 ± 14% para el diazepam-d5 y el nordiazepam-d5, respectivamente (Tabla 3). En la concentración alta, el efecto de la matriz y los valores de la RSD estuvieron en el mismo rango que en la concentración baja. Estas cifras de ME % están dentro del rango aceptable, ya que los resultados de otros estudios muestran que el efecto de matriz obtenido con matrices de agua ambiental puede ser relativamente alto . La exactitud del método se determinó por medio de la determinación de las recuperaciones de SPE a la baja y a la alta concentración de diazepam-d5 y nordiazepam-d5 (Tabla 3). Las recuperaciones relativas fueron de 88 ± 7,6% y 87 ± 12% para el diazepam-d5 en la concentración baja y alta, respectivamente, y de 98 ± 7,8% y 99 ± 6,1% para el nordiazepam-d5.
La precisión del sistema cromatográfico, expresada como los valores de RSD de los tiempos de retención obtenidos para el diazepam-d5 y el nordiazepam-d5 en muestras de aguas residuales extraídas, fue ≤ 0,62%. Los valores de RSD de las áreas de los picos para el diazepam-d5 y el nordiazepam-d5 en las muestras de aguas residuales extraídas fueron ≤ 7,8% («Los sistemas de espectrometría de masas de cuadrupolo en tándem de cromatografía líquida»). Además, la linealidad, expresada como el coeficiente de correlación (R2) de las curvas de calibración en las muestras de aguas residuales tratadas, fue de 0,988 y 0,957 para el diazepam y el nordiazepam, respectivamente.
En este estudio no se observó ningún arrastre en el sistema LC-MS/MS, ya que no se detectaron picos de los analitos ni de los compuestos marcados con isótopos en ninguna de las muestras de agua purificada Millipore inyectadas. No hubo indicios de que se produjera ninguna contaminación cruzada durante la manipulación de la muestra o la extracción en fase sólida, ya que las muestras de tampón fosfato extraídas no contenían ninguno de los compuestos objetivo. Por lo tanto, se consideró que el riesgo de obtener falsos positivos como resultado de la autocontaminación se había minimizado en este estudio.
Se determinaron el LOQ y el LOD para el diazepam-d5 y el nordiazepam-d5 en muestras de aguas residuales tratadas. Los límites de cuantificación se fijaron en 5,0 pM (1,4 ng L-1) tanto para el diazepam-d5 como para el nordiazepam-d5, donde las relaciones señal-ruido fueron de aproximadamente 10 y la precisión obtenida fue de 12,7 y 15,9 RSD % (n = 3) para los respectivos compuestos (Tabla 3), es decir, dentro de la precisión estipulada del 20% . Los valores LOQ obtenidos en el presente estudio están en el rango de lo que se ha logrado en otros estudios para el diazepam y el nordiazepam en muestras de aguas residuales tratadas . Sin embargo, en ese estudio, se extrajo un volumen de 200 mL de agua residual tratada, en comparación con 75 mL en nuestro método presentado. Los límites de detección fueron de 1,7 pM (0,49 ng L-1) y 2,0 pM (0,55 ng L-1) para el diazepam-d5 y el nordiazepam-d5, respectivamente (Tabla 3).
Como se ha comentado anteriormente («La estabilidad del diazepam y el nordiazepam en muestras acuosas ácidas y neutras,» Fig. 2), el diazepam y el nordiazepam demostraron ser estables durante 12 días a un pH de muestra de 7.0 cuando se almacenaban a temperatura ambiente o a 4 °C.
Cuantificación de diazepam y nordiazepam en muestras de agua ambiental
El método LC-MS/MS desarrollado se aplicó a muestras de agua ambiental para la determinación de diazepam y nordiazepam. Cabe destacar que el método desarrollado puede emplearse para las determinaciones de diazepam y nordiazepam en muestras ambientales en condiciones ácidas si se añaden a las muestras estándares internos ideales antes de su almacenamiento, es decir, compuestos marcados con isótopos de los compuestos objetivo. En este estudio, los compuestos marcados con isótopos, diazepam-d5 y nordiazepam-d5, se utilizaron como estándares internos para compensar la posible transformación de los compuestos y otras pérdidas, así como las variaciones durante el análisis.
Se analizaron muestras de aguas residuales y superficiales tratadas para detectar diazepam y nordiazepam. No hubo diferencias significativas, al nivel del 5% en una prueba t, entre las relaciones iónicas obtenidas para las soluciones estándar (Tabla 1) y las obtenidas para el diazepam o el nordiazepam de origen «natural» (P ≥ 0,07). Las concentraciones de diazepam y nordiazepam se determinaron en 8,5 (2,4 ng L-1) y 66 pM (18 ng L-1), respectivamente. En las muestras de la misma planta de tratamiento de aguas residuales recogidas 14 días después, las concentraciones se determinaron en 7,5 (2,1 ng L-1) y 75 pM (20 ng L-1) para el diazepam y el nordiazepam, respectivamente. Por lo tanto, se determinó que las concentraciones de nordiazepam eran aproximadamente un orden de magnitud superior a las del diazepam. Estos resultados concuerdan con los de otros estudios sobre efluentes de aguas residuales. Además, en algunas muestras de aguas residuales tratadas, reportadas en la literatura, se cuantificó el nordiazepam, pero no se detectó el diazepam . En el presente estudio, no se detectó ni diazepam ni nordiazepam en las aguas superficiales recogidas en el río Fyris, 3 km aguas arriba de la planta de tratamiento de aguas residuales Kungsängsverket, lo que indica que hay pocas emisiones antropogénicas de aguas residuales aguas arriba.