Los análisis de co-inmunoprecipitación de una sola molécula en tiempo real revelan la dinámica de señalización de Ras específica para el cáncer

Las imágenes en tiempo real de la co-inmunoprecipitación de una sola molécula

En primer lugar, mostramos que la cinética de una interacción proteína-proteína puede medirse en extractos celulares a nivel de una sola molécula (Fig. 1). Como modelo de interacción en una vía de señalización celular, elegimos la interacción entre Ras y Raf, que es el paso inicial de la vía MAPK conservada que está hiperactivada en muchos cánceres humanos5,6,7. Utilizamos el dominio de unión a Ras de cRaf (cRafRBD) y una versión de HRas que contiene una mutación de un solo punto, Q61L, que la hace constitutivamente activa6,8,9,10,11,12. Las imágenes de células vivas de las células HeLa que co-expresan estas dos proteínas mostraron un alto nivel de co-localización (Fig. 1a y Fig. Suplementaria S2). Fuimos capaces de dirigir esta co-localización con la translocación desencadenada por la rapamicina de HRas a la membrana plasmática13, lo que resultó en la localización concurrente de cRafRBD en los mismos puntos. La co-IP convencional también produjo una clara banda occidental, indicando una interacción selectiva proteína-proteína entre HRas constitutivamente activa y cRafRBD (Fig. 1b, izquierda). Sin embargo, descubrimos que esta banda proteica aparentemente clara contenía sólo menos del 5% de todas las proteínas de presa, lo que sugiere que las proteínas de presa podrían no estar unidas de forma estable a los cebos, sino que se eliminan a la porción de flujo a través de procesos de lavado (Fig. 1b, derecha y Fig. Suplementaria S3). Además, observamos que tanto las imágenes de células vivas como los enfoques de co-IP no pueden diseccionar la cinética real de esta interacción proteína-proteína quizás débil y transitoria.

(a) Estudio de co-localización de células vivas para la interacción HRas-cRafRBD. Las interacciones proteína-proteína entre HRas y cRafRBD se evaluaron observando la translocación de cRafRBD a la membrana plasmática junto con HRas. CA y DN denotan las formas constitutivamente activas y dominantemente negativas de HRas, respectivamente. Barra de escala, 10 μm. (b) Datos de co-IP convencionales para la interacción HRas-cRafRBD. Para los análisis de co-IP, se utilizaron las proteínas GST-cRafRBD (izquierda) y mCherry-HRas (derecha), respectivamente, como cebos inmovilizados en perlas. (c) Esquema de la co-IP de una sola molécula en tiempo real. (d) Imagen TIRF de mCherry-HRas inmovilizada en la superficie. Barra de escala, 10 μm. (e) Fotogramas sucesivos de imágenes en tiempo real de co-IP de una sola molécula. La traza en tiempo real de estos eventos de unión se muestra en f y se marca con un cuadrado rojo. Barra de escala, 1 μm. (f,g) Trazos ejemplares en tiempo real de la imagen de co-IP de una sola molécula en tiempo real. La señal consiste principalmente en una fluorescencia de fondo difusa superpuesta con una secuencia de picos de fluorescencia. (h) Un experimento de control negativo con DN HRas inmovilizado en superficie (S17N). (i) Distribución kbind para el experimento en f. Las tasas cinéticas relevantes se determinaron utilizando un ajuste de curva exponencial simple (líneas sólidas). (j) Un segundo experimento de control negativo con FLAG-eGFP inmovilizada en superficie. (k) Distribución de kdiss para el experimento en f. y kblinking para el experimento en j. Las tasas cinéticas relevantes se determinaron utilizando un ajuste de curva exponencial simple (líneas sólidas). Las barras de error denotan el error estándar (s.e.; n>200).

Para visualizar la interacción HRas-cRafRBD en tiempo real a nivel de una sola molécula, fusionamos el gen HRas con la proteína fluorescente roja mCherry y fusionamos cRafRBD con la proteína fluorescente verde mejorada (eGFP; Fig. 1c). Expresamos cada proteína en un grupo separado de células HEK293. Utilizamos la estrategia de pull-down de una sola molécula para inmovilizar mCherry-HRas en la superficie2,3 (Fig. 1c). A continuación, inyectamos el segundo lisado de células enteras que contenía eGFP-cRafRBD sobre la superficie inmovilizada de mCherry-HRas como en una co-IP convencional (Fig. 1c). Utilizamos un microscopio de reflexión interna total (TIR) para generar un campo eléctrico evanescente que excitara selectivamente los eGFP-cRafRBDs que se acercaran a menos de 100 nm de la superficie. Para observar las interacciones débiles proteína-proteína, las llegadas individuales de eGFP-cRafRBD a la superficie se monitorizaron en tiempo real con el segundo lisado de células enteras mantenido en la cámara (Fig. 1c).

La Figura 1f muestra un trazado típico en tiempo real de esta preparación de co-IP de una sola molécula. Cada traza se produjo integrando la señal de fluorescencia sobre una región de interés (ROI) circular con un área de 1,1 μm2 (Fig. 1e). Controlamos la densidad superficial de mCherry-HRas para mantener una media de 0,5 moléculas de HRas por ROI (Supplementary Fig. S4). También utilizamos un filtro gaussiano durante la integración de la señal y un umbral estricto para la detección de la señal con el fin de garantizar que las trazas en tiempo real informaran de los eventos de unión de las proteínas HRas individuales (Fig. 1g y Fig. Suplementaria S5). Cada traza en tiempo real consta claramente de dos partes: una fluorescencia de fondo y picos de fluorescencia individuales. Cada molécula de eGFP-cRafRBD, moviéndose según el movimiento browniano, debería pasar menos de 50 μs por visita a la capa de excitación TIR. Como 50 μs es tres órdenes de magnitud más corto que la resolución temporal de nuestro aparato de imagen (50 ms), el movimiento browniano de muchas moléculas de eGFP-cRafRBD produce un nivel constante de fluorescencia de fondo. Los picos de fluorescencia individuales, por otro lado, indican que una sola eGFP-cRafRBD ha interactuado con una molécula en la superficie el tiempo suficiente para sobrevivir a la integración de la señal de 50 ms.

A continuación, analizamos la cinética esencial de esta interacción proteína-proteína mediante el análisis de τoff, el tiempo entre eventos de unión, y τon, la duración de un solo evento de unión (Fig. 1g). Ajustando ecuaciones exponenciales simples a las distribuciones τoff y τon se obtienen las tasas cinéticas de kbind y kdiss, respectivamente. Para asegurar que los picos de fluorescencia son realmente el resultado de una interacción específica HRas-cRafRBD, realizamos el mismo experimento de unión eGFP-cRafRBD con HRas dominante negativo inmovilizado en superficie (S17N), que tiene una afinidad reducida por GTP14,15. Con la forma dominante negativa, la frecuencia de los picos de fluorescencia (kbind) se vio seriamente disminuida (Fig. 1h). Este control negativo demuestra que los picos de fluorescencia no son artefactos de simple adsorción superficial de eGFP-cRafRBD ni se deben a la inmovilización superficial de otras proteínas con interacciones espurias de eGFP-cRafRBD. En su lugar, estos trazos de picos de fluorescencia informan fielmente de los eventos de unión HRas-cRafRBD.

También es destacable que la duración de un único evento de unión suele durar sólo unos cientos de ms (Fig. 1f). Estudiamos la dinámica de parpadeo de FLAG-eGFP16 inmovilizada a una superficie con un anticuerpo anti-FLAG (Fig. 1j). El foto-parpadeo de FLAG-eGFP ocurre en promedio cada pocos segundos, dando una tasa cinética menor a 0.3 s-1, y esta tasa de foto-parpadeo de eGFP es un orden de magnitud más lenta que el kdiss que medimos (Fig. 1k). Además, revalidamos todas las tasas cinéticas de una sola molécula de kbind y kdiss utilizando un criterio de co-localización que requería la co-localización de las señales de fluorescencia de las proteínas mCherry-HRas y eGFP-cRafRBD (Fig. Suplementaria S6). Por lo tanto, la interacción HRas-cRafRBD debe tener efectivamente un rápido recambio, unas pocas veces por segundo11,12.

Visualización de los complejos de encuentro en la interacción Ras-Raf

El análisis detallado de la frecuencia de unión de HRas-cRafRBD (kbind) indica la existencia de complejos de encuentro de preequilibrio rápido17,18,19,20,21, que son intermedios sueltos de interacción proteína-proteína que deben poblarse antes de la formación del complejo final HRas-cRafRBD (Fig. 2). Cuando aumentamos la concentración de eGFP-cRafRBD de 5 a 50 nM, el kbind mostró un aumento parabólico (Fig. 2a), que puede ajustarse mejor a la ecuación de con un coeficiente de Hill (n) de 1,1 (22,23), una constante de disociación (K1) de 43 nM para la formación del complejo de encuentro, y un κon de 216 s-1 nM-1, que es la velocidad cinética de formación del estado de unión final a partir de un complejo de encuentro (Métodos Suplementarios y Fig. Suplementaria S7). kdiss, por otro lado, es en gran medida constante para las concentraciones de eGFP-cRafRBD que estudiamos (Fig. 2b). Estas tasas cinéticas medidas con nuestro co-IP de una sola molécula en tiempo real son muy consistentes con los informes anteriores que utilizan ensayos bioquímicos a granel (Tabla Suplementaria S1). Una nota es que hemos asumido una conformación predominante para el complejo final HRas-cRafRBD. Aunque nuestra suposición se ve corroborada por las distribuciones unimodales de la intensidad de los picos de fluorescencia (Fig. S8 suplementaria), no podemos descartar por completo la posibilidad de que haya múltiples conformaciones para el complejo HRas-cRafRBD con múltiples vías que conduzcan a ellas.

(a) kbind en función de la concentración de cRafRBD. Se muestra un aumento lineal de kbind como comparación. (b) kdiss en función de la concentración de cRafRBD. Se muestra como comparación el kblinking del experimento de la Fig. 1j. Las barras de error denotan la e.s. (n>180). (c-e) Trazos en tiempo real de la interacción HRas-cRafRBD. Obsérvese que la fluorescencia de fondo aumenta con la densidad superficial de HRas. Utilizamos la misma concentración de presa de =10 nM. (f) Aumento de la fluorescencia de fondo en función de la densidad de HRas de superficie. Tres conjuntos de datos, obtenidos con 10 nM (círculos rojos), 20 nM (triángulos verdes) de eGFP-cRafRBD y 20 nM de eGFP recombinante (diamantes azules), están normalizados por el correspondiente nivel de fluorescencia de fondo medido a una densidad de Ras superficial baja de 0,38 HRas por μm2. Las barras de error denotan la densidad estándar (n>100). (g) Frecuencia de picos de una sola molécula en función de la fluorescencia de fondo. Se utiliza el conjunto de datos obtenidos con 10 nM de eGFP-cRafRBD. Las barras de error denotan la e.s. (n>100).

Es de destacar que podemos visualizar los complejos de encuentro variando la densidad superficial de HRas. Si la fluorescencia de fondo es un simple producto del movimiento browniano de eGFP-cRafRBD, dependería únicamente de la concentración de cRafRBD. Sin embargo, la fluorescencia de fondo aumenta de forma pronunciada con la densidad superficial de HRas aunque las concentraciones de cRafRBD se mantengan constantes (Fig. 2c-f). A una alta densidad de Ras de 6,4 HRas por μm2, la fluorescencia de fondo total llega a ser tres veces mayor que la observada a 0,38 HRas por μm2 (Fig. 2c). Nuestra simulación numérica muestra que la presencia de procesos de unión paralelos en una determinada ROI sólo puede explicar menos del 5% del aumento observado (Fig. Suplementaria S9). Además, cuando las proteínas presa fueron cambiadas por eGFPs recombinantes, que no interactuaban con las proteínas HRas inmovilizadas en la superficie, su fluorescencia de fondo fue esencialmente invariable en el rango de densidad de HRas que estudiamos (Fig. 2f, diamantes azules). Por lo tanto, al tener una población densa de HRas activas en la superficie, parece que efectivamente hay más moléculas eGFP-cRafRBD que permanecen sobre la superficie de lo que se esperaría por pura difusión browniana. Estos complejos de encuentro surgen de interacciones rápidas de preequilibrio entre las proteínas HRas y cRafRBD24, cuya dinámica está más allá de nuestra resolución temporal.

A continuación nos preguntamos si los complejos de encuentro sirven realmente como sustratos para el complejo final HRas-cRafRBD. Para ello, evaluamos la frecuencia de los picos de fluorescencia generados por una sola proteína HRas inmovilizada en la superficie. Hemos razonado que si los complejos de encuentro son verdaderos intermediarios de la vía para el complejo final Ras-Raf, la frecuencia de picos de una sola molécula debería crecer con el aumento de la fluorescencia de fondo a pesar de la misma concentración de cRafRBD. Para obtener la frecuencia de espigas de una sola molécula en entornos densos de HRas, medimos kbind utilizando una ROI más pequeña de 3 por 3 píxeles (0,18 μm2) y dividimos el valor de kbind medido por el número medio de HRas en cada ROI de 3 por 3 píxeles (Fig. Suplementaria S10). En general, esta frecuencia de picos de una sola molécula aumentó con la fluorescencia de fondo (Fig. 2g, 10 nM eGFP-cRafRBD utilizado). Nuestra observación sugiere que las proteínas concentradas aguas abajo en forma de complejos de encuentro conducen a la formación del complejo Ras-Raf con una frecuencia aumentada.

Análisis de co-IP de molécula única de proteínas de señalización en cánceres

Hemos demostrado hasta ahora la medición en tiempo real de la cinética de interacción proteína-proteína durante la co-IP de molécula única. En estos experimentos, sin embargo, las proteínas cebo y presa están fusionadas con etiquetas de proteínas fluorescentes, lo que plantea la cuestión de si podemos extender esta técnica a las proteínas nativas. Para ello, expresamos la HRas mutada (G12V) en una línea celular epitelial de mama humana no tumorigénica (MCF10A) para transformarla en células cancerígenas25 (Fig. 3a). Estas células transformadas, que mostraron un crecimiento sin suero (Fig. Suplementaria S11), formaron tumores cuando se inyectaron en la almohadilla de grasa mamaria de ratones inmunocomprometidos (Fig. 3b). Los tejidos tumorales se obtuvieron 17 días después del xenoinjerto, y los tejidos de control se prepararon a partir de las mismas partes de ratones desnudos no tratados.

(a,b) Transformación de las células MCF10A en células cancerosas por transducción retroviral HRas (G12V). Se sabe que esta mutación de un solo punto hace que la HRas sea constitutivamente activa. La inyección de células cancerosas en la almohadilla mamaria de ratones desnudos conduce a la formación de tumores. Barra de escala, 5 mm. (c) Esquema del análisis western blot de una sola molécula. La competencia entre el Ras celular y la sonda para la unión al anticuerpo primario reduce el número de Ras de la sonda específicamente unidos a la superficie, lo que en consecuencia reduce el número de manchas fluorescentes. Obsérvese que como cada anticuerpo primario se une a dos proteínas Ras, una mancha fluorescente desaparece cuando ambos brazos de la cadena ligera están ocupados por Ras celular. (d) Medición prototípica de western blot de una sola molécula. Se utilizó 298 nM de mCherry-HRas como proteína objetivo. Con 32,5 nM de eGFP-HRas como sonda, la concentración de la proteína objetivo se midió en 288±1,4 nM. La barra de error denota la densidad relativa (n=20). (e) Niveles de expresión de Ras medidos a través del proceso de tumorigénesis de a,b. Las barras de error denotan s.d. (n=20). (f) Esquema de las imágenes de co-IP en tiempo real para HRas nativo. (g-j) Trazos en tiempo real de las imágenes de co-IP. Las concentraciones de HRas utilizadas para el pull down son 3,0 (g), 41,3 (h), 3,5 (i) y 49 nM (j). La frecuencia de los picos de fluorescencia aumentó significativamente para el extracto de tejido canceroso cuando el pull-down de HRas se incrementó de 1,6 a 22 HRas por μm2 (g frente a h). Esto no se observó con el extracto de tejido de control (i frente a j). (k) Esquema del inflado de kbind. En condiciones de escasez de cebos activos en la superficie, se obtiene un kbind constante, de una sola molécula, incluso cuando se aumenta el pull-down de cebos en la superficie (dos paneles de la izquierda). Sin embargo, pasado el umbral de 0,6 cebos activos por μm2, hay más de un cebo presente por ROI de media. Estos cebos múltiples tienen el efecto de aumentar el kbind medido desde cada ROI (panel derecho). (l) kbind en función del pull-down de HRas. Las barras de error denotan la e.s. (n>180).

En un esfuerzo por describir cuantitativamente esta tumorigénesis, utilizamos capas tándem de anticuerpos; un anticuerpo secundario biotinilado inmovilizado en superficie y un anticuerpo primario específico de Ras1,2. Esto permitió la captura de Ras nativo, sin etiquetar, así como de Ras etiquetado (Fig. 3c). Primero rastreamos los niveles de expresión de Ras cuantitativamente a través del proceso de tumorigénesis. Los extractos celulares o tisulares se mezclaron con un lisado celular HEK293 diluido, que contenía la sonda Ras (eGFP-HRas) de concentración conocida. Bajo las condiciones de reacción que saturan completamente los sitios de unión del anticuerpo primario, esta mezcla conduce a una competencia por la unión del anticuerpo específico Ras entre la sonda Ras y el Ras celular objetivo (Fig. 3c, izquierda). El número de moléculas de la sonda Ras unidas a los anticuerpos primarios disminuye a medida que aumenta la concentración de Ras celular diana. Esta unión competitiva disminuye el número de puntos de fluorescencia en la superficie (Fig. 3c, derecha), que sigue la ecuación de cuando se normaliza a una condición de unión de la sonda Ras solamente (Fig. Suplementaria S12). Al medir el número de moléculas de sonda unidas en varias diluciones diferentes, hemos sido capaces de medir específicamente y de forma robusta la concentración molar de Ras celular objetivo en extractos de células y tejidos (Fig. 3d y Fig. Suplementaria S12). Este análisis de western blot de una sola molécula indicó niveles de expresión de Ras de 42 y 59 nM en extractos de 1 mg ml-1 de las células MCF10A cancerosas y tejidos tumorales de xenoinjerto, respectivamente, mientras que se midió un nivel de referencia de 7 nM en extractos de 1 mg ml-1 del tejido de control (Fig. 3e).

Además, también pudimos replicar las imágenes de co-IP de una sola molécula en tiempo real de las Figs. 1 y 2 en esta superficie nativa de captura de Ras. Después de atraer a HRas de extractos de tejido tumoral o de control en la superficie de anticuerpos en tándem, aplicamos un lisado celular de sondeo, un lisado celular HEK293 diluido con 20 nM de proteínas presa eGFP-cRafRBD (Fig. 3f). Analizamos las trazas de co-IP en tiempo real para determinar las tasas cinéticas kbind y kdiss (Fig. 3g-j). Es importante señalar que la información sobre la concentración del análisis de western blot de una sola molécula (Fig. 3e) fue crucial para asegurar una concentración específica de HRas para cada pull down cuando los extractos de tejido tumoral y de control tenían niveles de expresión de HRas dispares. Utilizando los datos de calibración para el pull down de superficie (Fig. Suplementaria S13), la información de concentración se convirtió finalmente en una densidad de superficie específica de proteínas HRas pull down (Fig. 3g-j).

Estudiamos sistemáticamente el cambio en kbind mientras se aumentaba con precisión la densidad de superficie de proteínas HRas pull down (Fig. 3k). Suponemos que, como resultado de la regulación celular, sólo un subconjunto de proteínas HRas en la superficie debería estar en el estado de carga de GTP y mostrar eventos de unión activos con las proteínas presa. Bajo una condición escasa en la que la distancia entre moléculas HRas activas vecinas es mucho mayor que el diámetro de cada ROI, la cinética observada de cada ROI debería ser independiente de la inmovilización total de la superficie de las HRas y simplemente informar de la actividad de las proteínas HRas individuales (Fig. 3k, dos paneles de la izquierda y Fig. Suplementaria S14). A medida que la superficie se llena de HRas activas, debería haber un umbral en el que empieza a haber más de una molécula de HRas activa por ROI. Una vez superado este umbral, las moléculas HRas activas adicionales en cada ROI producirían picos de fluorescencia adicionales que, en consecuencia, inflarían kbind (Fig. 3k, panel derecho y Fig. S14 suplementaria). De hecho, observamos dicha tendencia bifásica de kbind para el tejido tumoral, con un umbral a ~3 HRas derribadas por μm2 (Fig. 3l).

De este modo, por debajo del umbral de inflación de kbind, la cinética de picos observada reflejaría en gran medida la actividad de las moléculas de un solo HRas. En particular, a 1,6-1,9 HRas derribadas por μm2, se observaron valores de kbind similares de 0,28 s-1 y 0,22 s-1 para las proteínas HRas derivadas del tumor y del tejido de control, respectivamente (Fig. 3l). Las mediciones de kdiss también fueron muy similares a 2,5 s-1 (Supplementary Fig. S15). La HRas oncogénica única derivada del tumor tenía, por tanto, una constante de disociación aparente de 180 nM, y esto era muy similar a la constante de disociación de 230 nM para la HRas activa del extracto de tejido de control. Nuestras observaciones indican un hecho crucial: la actividad de una sola molécula de la HRas oncogénica no es dramáticamente diferente de la de una HRas de tipo salvaje activada.

Entonces, ¿qué distingue este estado canceroso del estado normal? El umbral de inflación de kbind nos permite cuantificar otra estadística importante de las proteínas de señalización celular, la proporción de proteínas HRas que se unen activamente con cRafRBD. Intuitivamente, el umbral para la inflación de kbind debería corresponder a una densidad superficial específica de proteínas de cebo «activas». En nuestro esquema de imágenes, este umbral se encontró en 0,6 cebos activos por μm2, que no depende de los tipos detallados de proteínas cebo y presa (Supplementary Fig. S13). Como el umbral para la inflación de kbind se observó en un total de 3 HRas derribadas por μm2, se estimó directamente que la fracción de HRas activas era de aproximadamente el 20% para el tejido tumoral. Por el contrario, no pudimos observar la inflación de kbind cuando se extrajeron incluso 25 proteínas HRas por μm2 del tejido de control (Fig. 3l). Estas observaciones indican que el HRas oncogénico derivado del tejido tumoral tiene una fracción activa mayor que el HRas derivado del tejido de control en un orden de magnitud.

Por último, nos preguntamos si esta mayor proporción de Ras activo podría ser una simple consecuencia de la sobreexpresión de HRas en el tumor xenografiado. Las proteínas HRas sobreexpresadas podrían superar en número a los socios de unión putativos, quedando disponibles para la unión a Raf marcada con eGFP. Para abordar directamente esta cuestión, probamos dos líneas celulares de cáncer de mama humano, MCF-7 que tiene KRas de tipo salvaje y MDA-MB-231 que tiene una forma mutante de KRas (G13D; Fig. 4). En particular, se sabe que las células MDA-MB-231 muestran adicción al oncogén del gen KRas mutado y dependen críticamente de la señalización aberrante de KRas para su supervivencia26,27. Utilizando estas dos líneas celulares, también podemos determinar si nuestros métodos se aplican a la señalización de KRas, que tiene una importancia fundamental en el diagnóstico molecular y el tratamiento de muchos cánceres humanos28.

(a,b) Análisis de western blot de molécula única de los niveles de expresión de KRas. Se utilizó KRas marcado con eGFP como sonda Ras. El nivel de expresión del KRas de tipo salvaje en la línea MCF-7 se midió en 17,3±1,3 nM, mientras que el del KRas mutante G13D en la línea MDA-MB-231 se midió en 5,5±0,3 nM por 1 mg ml-1 de extractos. Las barras de error denotan s.d. (n=200). (c) kbind en función del pull down de KRas. Obsérvese el mismo valor de kbind compartido por el KRas de tipo salvaje y el mutante en la región cinética de una sola molécula (la línea plana común). El umbral de kbind se midió en 1,2 KRas derribadas por μm2 para la KRas mutante de MDA-MB-231, lo que dio una fracción activa estimada del 50%. Este valor era un orden de magnitud superior al 6% de la KRas de tipo salvaje de MCF-7, cuyo umbral era de 10 KRas derribadas por μm2. Las barras de error denotan la e.s. (n>150).

Derribamos directamente KRas de estos extractos celulares utilizando un anticuerpo primario específico de KRas. Nuestro análisis de western blot de una sola molécula mostró que el KRas de tipo salvaje en las células MCF-7 tiene una concentración mayor (17 nM) que el KRas mutante en las células MDA-MB-231 (5,5 nM en extractos de 1 mg ml-1; Fig. 4a y Fig. Suplementaria S16). Teniendo en cuenta la adicción al oncogén KRas de las células MDA-MB-231, su menor nivel de expresión de KRas fue una observación bastante inesperada. Además, la cinética de señalización de una sola molécula para el KRas de tipo salvaje y el mutante es esencialmente la misma (Fig. 4c, la línea plana común; véase la Fig. S15 suplementaria para kdiss). Por otro lado, nuestra co-IP de molécula única en tiempo real resuelve que el umbral para la inflación de kbind para el KRas mutante de MDA-MB-231 se identifica en 1,2 KRas derribadas por μm2, mientras que el umbral se observa en ~10 KRas derribadas por μm2 para el KRas de tipo salvaje de MCF-7 (Fig. 4c). Como la inflación de kbind se produce siempre a 0,6 cebos activos por μm2, estos umbrales dispares indican directamente que la fracción activa del KRas mutante que se une fuertemente a su objetivo aguas abajo (15 nM cRafRBD) es del 50%, casi un orden de magnitud superior al 6% mostrado por el KRas de tipo salvaje. Por lo tanto, la mayor fracción activa mostrada por el Ras mutante oncogénico no es claramente un artefacto de sobreexpresión, ya que el KRas mutante se expresaba a niveles más bajos, pero mostraba una mayor fracción activa que el tipo salvaje.