- Abstract
- Introducción
- Pacientes y métodos
- Pacientes
- Cepas bacterianas y métodos microbiológicos
- Agentes antimicrobianos
- Amplificación y secuenciación del ADN de las regiones que determinan la resistencia a las quinolonas
- Detección genética de los genes de las metalobacterias
- Preparación de las proteínas de la membrana externa
- Resultados
- Susceptibilidad
- Resistencia a las fluoroquinolonas
- Resistencia a los carbapenems
- Discusión
- Notas de los autores
Abstract
Objetivos: Pseudomonas putida es un patógeno oportunista poco común, generalmente susceptible a los agentes antimicrobianos. Los datos relativos a la resistencia a los agentes antimicrobianos en aislados clínicos de P. putida son limitados.
Pacientes y métodos: Se caracterizaron las susceptibilidades a fluoroquinolonas, carbapenems y otros antibióticos en cinco aislados clínicos de P. putida recuperados de diferentes pacientes con infecciones del tracto urinario como patógenos causantes. La resistencia a las fluoroquinolonas y a los carbapenems se caracterizó genéticamente mediante los métodos de PCR y secuenciación del ADN. Los perfiles de las proteínas de la membrana externa (OMP) se caracterizaron por SDS-PAGE.
Resultados: Cuatro de los cinco aislados fueron resistentes o intermedios tanto a las fluoroquinolonas como a los carbapenems. Las secuencias de nucleótidos en las regiones determinantes de la resistencia a las quinolonas sugirieron que las mutaciones de aminoácidos como Thr-83→Ile en GyrA y Glu-469→Asp en GyrB pueden contribuir a la alta resistencia a las fluoroquinolonas. Cuatro aislados productores de metallo-β-lactamasas que mostraron resistencia a los carbapenems portaban los genes de metallo-β-lactamasas de tipo IMP. Un aislado de P. putida que presentaba las CIM más altas de carbapenems mostró un efecto combinado de producción reducida de OMP de 46 kDa y de producción de metallo-β-lactamasa.
Conclusiones: Este estudio identificó mecanismos de resistencia a fluoroquinolonas y carbapenems en aislados clínicos de P. putida.
Introducción
Pseudomonas putida, un bacilo Gram negativo no fermentador, es un patógeno humano oportunista responsable de bacteriemia y sepsis en pacientes neonatales, neutropénicos y con cáncer, así como de infecciones del tracto urinario (ITU).1-4 Aunque es poco común, P. putida puede ser una causa de infecciones nosocomiales en huéspedes comprometidos.3
La mayoría de los P. putida son susceptibles a los agentes antimicrobianos como los carbapenems, las fluoroquinolonas y los aminoglucósidos.5-7 Sin embargo, se han notificado aislados clínicos de P. putida que producen metalo-β-lactamasas que confieren resistencia a los β-lactámicos, incluidos los carbapenems.3,4,8,9 Además, recientemente se han notificado aislados productores de metalobactamasas que muestran resistencia a la ciprofloxacina, la gentamicina y la tobramicina, además de a los β-lactámicos.3 La aparición de P. putida resistente a múltiples fármacos se ha convertido en una causa de dificultad en el tratamiento de las infecciones y supone un riesgo de transmisión nosocomial.
En algunos estudios anteriores, la resistencia a los antibióticos en P. putida se ha caracterizado con respecto a la producción de metalo-β-lactamasas y las características de los sistemas de eflujo.3,4,8-12 El P. putida resistente a los carbapenemes produce con frecuencia metalobactamasas de tipo IMP y VIM, según informes de Europa, Corea y Japón.3,4,8,9,9a Los sistemas de eflujo como TtgABC, MepABC, TtgDEF y ArpABC también pueden contribuir a la resistencia a múltiples fármacos en el P. putida.10-12Pseudomonas aeruginosa tiene la capacidad de volverse rápidamente resistente durante el curso del tratamiento,13 aunque no está claro si el P. putida tiene el mismo potencial. Para evaluar el riesgo de que surja una resistencia a los antibióticos, se necesitan abundantes datos sobre la resistencia a los agentes antimicrobianos en los aislados clínicos de P. putida. En este estudio, determinamos la susceptibilidad a los agentes antimicrobianos, incluidas las fluoroquinolonas y los carbapenems, y caracterizamos los mecanismos de resistencia a las fluoroquinolonas y los carbapenems, en los aislados clínicos de P. putida recuperados como patógenos causantes de ITU durante un período de un año en nuestro hospital.
Pacientes y métodos
Pacientes
Cinco pacientes (cuatro varones y una mujer) diagnosticados de ITU aguda, repetida o crónica causada por P. putida en el Hospital Universitario de Hamamatsu se incluyeron en nuestro estudio desde octubre de 2001 hasta septiembre de 2002.
Cepas bacterianas y métodos microbiológicos
Las cepas utilizadas en este estudio fueron cinco aislados clínicos de P. putida recuperados de diferentes pacientes como patógenos causantes. La identificación se realizó mediante pruebas bioquímicas estándar en nuestro laboratorio de microbiología clínica. Todos los aislados se obtuvieron de la orina. Los patrones de fragmentos restringidos por SpeI del ADN cromosómico de estos cinco aislados variaban (Figura 1). Las bacterias se almacenaron a -70°C en caldo de infusión de corazón (Nissui Pharmaceutical, Tokio, Japón) con un 20% de glicerol. Posteriormente, las bacterias se inocularon en placas de agar infusión de corazón (Nissui Pharmaceutical) y se incubaron a 37°C durante la noche. Las CMI se determinaron mediante un método de dilución en agar como el descrito por el Instituto de Normas Clínicas y de Laboratorio (CLSI), anteriormente el Comité Nacional de Normas de Laboratorio Clínico (NCCLS).14 Las pruebas de susceptibilidad se realizaron utilizando agar Mueller-Hinton (Nippon Becton Dickinson, Tokio, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los criterios interpretativos de la CIM para la ceftazidima, el imipenem, el meropenem, la norfloxacina, la levofloxacina, la gatifloxacina, la gentamicina, la amikacina y la minociclina siguieron los del CLSI/NCCLS.14 No se definieron los puntos de rotura de la CIM de otros agentes antimicrobianos.
Agentes antimicrobianos
Amplificación y secuenciación del ADN de las regiones que determinan la resistencia a las quinolonas
Se extrajo el ADN cromosómico de los aislados de P. putida como se ha descrito anteriormente.15 La amplificación por PCR se realizó con conjuntos de cebadores específicos. Un conjunto de cebadores de 5′-gacggcctgaagccggtgcac-3′ y 5′-gcccacggcgataccgctgga-3′ amplificó un fragmento de 417 pb de las regiones determinantes de la resistencia a las quinolonas (QRDR) del gen gyrA desde las posiciones 115 a 531.16 Un conjunto de cebadores 5′-agtacttcgccgacttcct-3′ y 5′-tacaggcggacaggctt-3′ amplificó un fragmento de 739 pb de las QRDR del gen gyrB desde las posiciones 1073 a 1811.17 Un conjunto de cebadores de 5′-tctacgccatgagcgaactgg-3′ y 5′-agcagcacctcggaatagcg-3′ amplificó un fragmento de 262 pb de los QRDR del gen parC desde las posiciones 158 a 419.18 Las amplificaciones se llevaron a cabo con la enzima Advantage-GC2 (BD Biosciences Clontech Japan, Tokio, Japón) según las instrucciones del fabricante. Los QRDR se secuenciaron utilizando un kit de reacción lista para la secuenciación del ciclo BigDye v3.0 Taq con AmpliTaq ADN polimerasa (Perkin-Elmer, Foster City, CA, EE.UU.) y un sistema automatizado de secuenciación de ADN (analizador genético ABI PRISM 310, Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.).
Detección genética de los genes de las metalobacterias
Preparación de las proteínas de la membrana externa
Las proteínas de la membrana externa (OMP) se prepararon como se ha descrito previamente.21 Las muestras se analizaron por SDS-PAGE.
Resultados
Susceptibilidad
Los resultados de las pruebas de susceptibilidad para las fluoroquinolonas y los carbapenems se resumen en las tablas 1 y 2, respectivamente. Las CMI de los β-lactámicos oscilaron entre >128 mg/L para la ampicilina y la cefaloridina, entre 2 y >128 mg/L para la ceftazidima, entre 1 y 128 mg/L para el imipenem, entre 0,5 y >128 mg/L para el panipenem, entre 4 y >128 mg/L para el meropenem y entre 1 y >128 mg/L para el biapenem. Los rangos de CMI de los aminoglucósidos y la minociclina fueron los siguientes 0,25 a 8 mg/L para la gentamicina, 0,5 a 8 mg/L para la amikacina, 0,5 a 1 mg/L para la kanamicina y 4 a 64 mg/L para la minociclina. Cuatro aislados eran resistentes o intermedios tanto a las fluoroquinolonas como a los carbapenems, mientras que un aislado, HU2001-429, era susceptible tanto a los β-lactámicos como a las fluoroquinolonas. Tres aislados de P. putida, HU2001-412, HU2001-419 y HU2001-451, mostraron resistencia a todos los β-lactámicos examinados, como ceftazidima, imipenem y meropenem. Tres aislados, HU2001-412, HU2001-419 y HU2002-467, mostraron una alta resistencia a las fluoroquinolonas (>128 mg/L), incluyendo norfloxacina, levofloxacina, esparfloxacina, gatifloxacina y pazufloxacina, y también resistencia a la minociclina (32 a 64 mg/L). En los cinco aislados, el rango de CIM para sitafloxacino se situó entre ≤0,125 y 8 mg/L.
Resistencia a las fluoroquinolonas
Resistencia a los carbapenems
De los cinco aislados de P. putida, cuatro que mostraban resistencia a los carbapenems eran portadores del gen de la metallo-β-lactamasa de tipo IMP, mientras que los genes de la metallo-β-lactamasa de tipo VIM no se detectaron por PCR (Tabla 2). Los rangos de CMI de los carbapenems en P. putida que portaban los genes de metallo-β-lactamasa de tipo IMP fueron los siguientes: 8 a 128 mg/L para imipenem, 32 a >128 mg/L para panipenem, 128 mg/L o más para meropenem y 32 a >128 mg/L para biapenem. En P. putida HU2001-451, que mostró las CIM más altas de carbapenems entre los cinco aislados, la producción de OMP de 46 kDa fue indetectable por SDS-PAGE, mientras que las de P. putida HU2001-412, HU2001-419, HU2001-429 y HU2002-467 se detectaron de forma similar (Tabla 2).
Discusión
En este estudio, caracterizamos las susceptibilidades a fluoroquinolonas y carbapenems en cinco aislados clínicos de P. putida aislados de diferentes pacientes con ITU aguda, repetida o crónica. Los cinco aislados mostraron diferentes genotipos de PFGE, lo que sugirió que ninguna de las infecciones causadas por estos P. putida eran nosocomiales. Cuatro de los cinco aislados eran resistentes o intermedios tanto a las fluoroquinolonas como a los carbapenems. Tres aislados mostraron una alta resistencia (>128 mg/L) a todas las fluoroquinolonas examinadas, excepto a la sitafloxacina. Entre las fluoroquinolonas investigadas en este estudio, la sitafloxacina mostró una potencia superior contra los aislados de P. putida. Estos aislados altamente resistentes a las fluoroquinolonas eran también resistentes a los carbapenems y a la minociclina. Todos los aislados eran sensibles a los aminoglucósidos, como la amikacina.
Los estudios sobre la resistencia a las fluoroquinolonas en P. putida son limitados.6,12 En P. aeruginosa, los principales mecanismos responsables de la resistencia a las fluoroquinolonas incluyen mutaciones de aminoácidos en la ADN girasa o la topoisomerasa IV causadas por mutaciones en los QRDR de GyrA y ParC, mientras que algunos informes han sugerido la participación de mutaciones de GyrB en la resistencia a las fluoroquinolonas.18,22 Un mecanismo de resistencia secundario en P. aeruginosa que implica sistemas de eflujo contribuye a reducir la susceptibilidad a las fluoroquinolonas.22,23 En este estudio, se compararon las alteraciones de aminoácidos en los QRDR de GyrA, GyrB y ParC entre cinco aislados clínicos de P. putida. El P. putida resistente a las fluoroquinolonas tenía mutaciones adicionales como Thr-83→Ile en GyrA y Glu-469→Asp en GyrB, que se correspondían con las mutaciones encontradas en el P. aeruginosa resistente a las fluoroquinolonas.22,23 Estos resultados indican que las mutaciones de aminoácidos en los QRDR, como Thr-83→Ile en GyrA y Glu-469→Asp en GyrB, pueden contribuir a la alta resistencia a las fluoroquinolonas, aunque no se determinó si la transformación mediante plásmidos que portan los genes gyrA, gyrB o parC de tipo salvaje en dichos aislados reduciría las CIM de las fluoroquinolonas.24 El rango de CIM de la sitafloxacina estaba entre ≤0,125 y 8 mg/L para los cinco aislados de P. putida. Aunque informes anteriores han demostrado que la sobreexpresión de los sistemas de eflujo TtgABC, MepABC, TtgDEF y ArpABC también puede contribuir a la resistencia a múltiples fármacos en P. putida,10,11,12 el papel de los sistemas de eflujo no quedó claro en este estudio.
Se ha informado de la resistencia a carbapenem en P. putida causada por la producción de metalo-β-lactamasas.3,4,8,9,9a Estas metalo-β-lactamasas encontradas en P. putida incluían los tipos IMP y VIM.3,4,8,9,9a En los cuatro P. putida resistentes a los carbapenemes, la producción de metalo-β-lactamasas se detectó mediante un método de difusión en disco (datos no mostrados). Estos aislados eran portadores de los genes de la metallo-β-lactamasa de tipo IMP, mientras que los genes de la metallo-β-lactamasa de tipo VIM no se detectaron por PCR. La prevalencia de P. putida productora de metaloproteínas es un importante problema clínico, ya que representa un reservorio de determinantes genéticos de la resistencia a los β-lactámicos. En P. aeruginosa, otros mecanismos importantes de resistencia a los carbapenems incluyen la impermeabilidad mutacional que surge a través de la pérdida de OprD -un canal transmembrana formador de porinas accesible a los carbapenems pero no a otros β-lactámicos-, además de la producción de metaloproteínas.21,25,26 La pérdida de OprD da lugar a la resistencia a imipenem y a la reducción de la susceptibilidad a meropenem en P. aeruginosa.27 En P. putida HU2001-451, que muestra las CIM más altas (≥128 mg/L) de todos los carbapenems entre cuatro aislados resistentes a carbapenems, la producción de OMP de 46 kDa se redujo en comparación con las de otros aislados. Los perfiles de OMP de P. putida HU2001-451 fueron similares a los de P. aeruginosa resistente a los carbapenems, en los que se identificó una producción reducida de OprD en nuestro estudio anterior.21 Estos resultados mostraron un efecto combinado de la producción reducida de OMP de 46 kDa que coexiste con la producción de metalobactamasas en la resistencia a los carbapenems en el aislado, aunque no está claro si otras β-lactamasas tienen relevancia en la resistencia a los carbapenems.
En conclusión, hemos caracterizado la resistencia a las fluoroquinolonas y a los carbapenems en aislados clínicos de P. putida. Nuestros resultados indican que las mutaciones de aminoácidos en los QRDR, como Thr-83→Ile en GyrA y Glu-469→Asp en GyrB, pueden contribuir a la alta resistencia a las fluoroquinolonas en P. putida. Cuatro aislados de P. putida productores de metallo-β-lactamasa que mostraron resistencia a los carbapenems portaban el gen de la metallo-β-lactamasa de tipo IMP. Encontramos un efecto combinado de la producción reducida de OMP de 46 kDa y la producción de metallo-β-lactamasas que aumentó la resistencia a los carbapenems en un aislado de P. putida que mostraba las CIM más altas de los carbapenems.
Damos las gracias al Laboratorio Médico Miroku, Saku, Nagano, Japón, por el análisis PFGE. T. H. cuenta con el apoyo de una beca de ayuda a la investigación científica (17790353) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón.
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Notas de los autores
1Departamento de Medicina de Laboratorio, Escuela de Medicina de la Universidad de Hamamatsu, 1-20-1 Handa-yama, Hamamatsu 431-3192, Japón; 2Grupo de Investigación de Control de Infecciones, Escuela de Medicina de la Universidad de Hamamatsu, 1-20-1 Handa-yama, Hamamatsu 431-3192, Japón; 3División de Farmacia, Facultad de Medicina de la Universidad de Hamamatsu, 1-20-1 Handa-yama, Hamamatsu 431-3192, Japón; 4Departamento de Medicina de Laboratorio Clínico, Facultad de Medicina de la Universidad de Kioto, 54 Shogoin-Kawahara-cho, Sakyo-ku, Kioto 606-8507, Japón
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