Mejorar la solubilidad de la proteína recombinante utilizando la etiqueta MBP

Recursos «Centros de recursos técnicos «Recursos técnicos de las proteínas «Técnicos Notas «Etiqueta MBP

E. coli

La generación de proteínas recombinantes requiere el uso de un huésped de expresión y E. coli suele ser la mejor opción para este fin. La combinación de una genética sencilla, la facilidad de cultivo, la rapidez de expresión y los altos rendimientos lo convierten en un huésped atractivo, mientras que la falta de una maquinaria postraduccional eficiente, el sesgo en el uso de codones y la dificultad para producir proteínas de mayor peso molecular, lo hacen desventajoso. Sin embargo, uno de los mayores males de la expresión de E.coli es la expresión insoluble, el fenómeno en el que la sobreexpresión recombinante da lugar a la formación de agregados proteicos insolubles llamados cuerpos de inclusión.

Modo de tratar los cuerpos de inclusión y mejorar la solubilidad de la proteína diana

Cuando se forman cuerpos de inclusión, los científicos suelen intentar un proceso engorroso llamado solubilización y replegado de la proteína in vitro para recuperar la proteína soluble o intentan la optimización de la expresión a nivel de proceso o molecular para evitar los problemas de insolubilidad .

Los ejemplos de optimización a nivel de proceso incluyen métodos que no requieren la ingeniería de la diana. Por ejemplo, la optimización de las condiciones de expresión, el ajuste de las condiciones de crecimiento e inducción, el cambio de medios, los tampones, etc. Una alternativa sería probar un enfoque molecular y manipular la proteína objetivo eliminando elementos indeseables dentro de su secuencia creando truncamientos o mutando ciertos aminoácidos para hacer la proteína más soluble. También se podría adoptar un enfoque racional de mutagénesis dirigida al sitio, basado en la información de la estructura, o adoptar un enfoque de evolución dirigida y buscar la solubilidad de mutantes puntuales, deleciones y fragmentos al azar. Un enfoque mejor y más sencillo sería adoptar una estrategia de socio de fusión y utilizar un socio de fusión anterior que haga que la proteína objetivo sea más soluble.

Enfoque de socio de fusión para mejorar la solubilidad de las proteínas

Con este enfoque, una proteína o péptido difícil de expresar se fusiona con otra proteína estable y altamente soluble para estabilizar la expresión, con la idea de que la proteína de fusión impulsará la expresión resultante. Aunque muchas proteínas son altamente solubles, no todas son eficaces como potenciadores de la solubilidad de las proteínas. En este sentido, la proteína de unión a maltosa puede ser un socio muy útil para la solubilidad de las proteínas. En un estudio comparativo orientado a investigar sus propiedades de mejora de la solubilidad de las proteínas, la etiqueta MBP de E. coli demostró ser un socio de solubilidad de proteínas mucho más eficaz que las proteínas glutatión-S-transferasa (GST) y tiorredoxina (TRx).

Figura 1: Recomendación de los científicos de GenScript sobre el diseño del constructo

Sobre la etiqueta MBP y su mecanismo de acción

La MBP es una proteína de aproximadamente 42 kDa, que se produce de forma natural en E. coli, codificada por el gen malE, y que es responsable de la captación, la descomposición y el transporte de la maltodextrina, un carbohidrato. Desarrollada originalmente como etiqueta de expresión de proteínas en la década de 1980, se sabe que mejora significativamente la solubilidad de una variedad de proteínas objetivo fusionadas aguas abajo. Aunque el mecanismo exacto de la mejora de la solubilidad de la proteína por la etiqueta MBP no está claro, se sabe que estabiliza y protege su proteína pasajera posterior de la degradación proteolítica durante y después de la síntesis de la proteína. Los rendimientos citoplásmicos de las proteínas fusionadas con MBP también suelen ser mayores porque la proteína de fusión proporciona contextos fiables para la iniciación eficiente de la traducción. También se propone que la etiqueta MBP podría actuar como chaperona mediante interacciones a través de un punto caliente expuesto al disolvente en su superficie que estabiliza la proteína pasajera, que de otro modo sería insoluble.

El uso de la etiqueta MBP

Aunque se ha demostrado que la etiqueta MBP fusionada al N- o al C-terminal aumenta la expresión soluble recombinante, un enfoque común es fusionarla al N-terminal. Lamentablemente, dado que ninguna etiqueta puede ser ideal para todas las aplicaciones, para aumentar la versatilidad de las etiquetas y las aplicaciones posteriores, se han desarrollado métodos de etiquetado combinatorio para diversas necesidades. Dos etiquetas de afinidad expresadas en tándem junto con un sitio de corte de proteasa que precede a la proteína objetivo, permite el uso de múltiples estrategias de purificación. Al incorporar una etiqueta que mejora la solubilidad en combinación con una etiqueta de purificación, se consiguen mejoras en la solubilidad de la proteína y en los rendimientos de expresión, así como métodos para una purificación eficiente

Figura 2: Un esquema general para la estrategia de diseño de construcciones – la combinación de etiquetas de afinidad/solubilidad en el N-terminal, el sitio de corte proteolítico seguido de la proteína objetivo puede dar buenos resultados, especialmente para las proteínas objetivo insolubles. Una secuencia de enlace a menudo puede ayudar con los problemas de escisión proteolítica.

Purificación de proteínas marcadas con MBP

Además de mejorar la solubilidad de las proteínas, otra ventaja de utilizar una estrategia de fusión con MBP es facilitar la purificación de la proteína diana aguas abajo. La MBP es una etiqueta de afinidad natural que se une a la resina de amilosa y puede utilizarse para la purificación de afinidad de un solo paso mediante la unión a la amilosa reticulada. Las proteínas recombinantes fusionadas con la etiqueta MBP unidas a la amilosa inmovilizada se eluyen típicamente en condiciones no desnaturalizantes utilizando maltosa .

Desventajas de esta estrategia

• La escisión de la proteína diana puede ser un problema debido al impedimento estérico de la etiqueta MBP
• La resina de amilosa puede ser frágil y relativamente cara
• Precipitación de la proteína diana después de la escisión
• Algunas proteínas de fusión MBP no se unen eficazmente a la resina de amilosa e incluso cuando lo hacen, el rendimiento puede ser un problema

Conclusión

Aunque no hay una solución simple y global para abordar los problemas de insolubilidad en la expresión de E.coli, una construcción bien diseñada y una estrategia de expresión cuidadosamente elaborada pueden proporcionar la proteína soluble deseada. La MBP es una etiqueta de solubilidad fiable para la producción de proteínas solubles recombinantes y, aunque la solubilidad es uno de los elementos más importantes de una campaña de producción de proteínas, el objetivo final no debe ser siempre la solubilidad. Los niveles de expresión, la actividad de la proteína, la pureza, la homogeneidad y la estabilidad son factores importantes que también deben tenerse en cuenta antes de embarcarse en una campaña de producción de proteínas recombinantes.

Pocas publicaciones que demuestran la utilidad de la etiqueta MBP

La producción de fusocinas mediante la fusión de proteínas de unión MBP -Maltosa-Binding Protein Fusion permite la expresión bacteriana de alto nivel y la purificación de derivados bioactivos de citoquinas de mamíferos (septiembre de 2014)

El rescate de proteínas propensas a la agregaciónproteínas propensas a la agregación utilizando MBP -El rescate de proteínas propensas a la agregación en Escherichia coli con una etiqueta dual His₆-MBP (mayo de 2014)

MBP para la producción de proteínas solubles en E. coli -La proteína de unión a la maltosa marcada con hexahistidina como socio de fusión para la producción de proteínas recombinantes solubles en Escherichia coli (2009)

1. Pryor, K. A., y Leiting, B. (1997). Expresión de alto nivel de proteínas solubles en Escherichia coli utilizando un sistema de fusión de doble afinidad de His6-tag y proteína de unión a maltosa. Protein Expr. Purif. 10, 309-319
2. Routzahn, K. M. y Waugh, D. S. (2002). Efectos diferenciales de las etiquetas de afinidad suplementarias en la solubilidad de las proteínas de fusión MBP. J. Struct. Funct. Genomics 2, 83-92
3. Nallamsetty, S., Austin, B. P., Penrose, K., J., y Waugh, D. S. (2005) Gateway vectors for the production of combinatorially tagged His6-MBP fusion proteins in the cytoplasm and periplasm of Escherichia coli. Protein Sci. 14, 2964-2971
4. Esposito D, Chatterjee DK: Mejora de la expresión de proteínas solubles mediante el uso de etiquetas de fusión. Curr Opin Biotechnol 2006, 17:353-8.184.
5. Peti W, Page R: Strategies to maximize heterologous protein expression in Escherichia coli with minimal cost. Protein Expr Purif 2007, 51:1-10.]
6. Wilkes D.M., Expression and purification of the first nucleotide-binding domain and linker region of human multidrug resistance gene product: comparison of fusions to glutathione S-transferase, thioredoxin and maltose-binding protein. Biochemical Journal 1999, 77-81
7. Fox JD, Kapust RB, Waugh DS: Single amino acid substitutions on the surface of Escherichia coli maltose-binding protein can have a profound impact on the solubility of fusion proteins. Protein Sci 2001, 10:622-630

¿Planificando un proyecto de Expresión Bacteriana? Obtenga un presupuesto gratuito en cuestión de segundos para nuestros paquetes de expresión de proteínas garantizadas BacPower™.

Cotizaciones y pedidos

#El presupuesto automático se generará sólo si las secuencias cumplen los requisitos para el servicio garantizado, según lo determinado por nuestra plataforma de análisis de secuencias patentada, en cuyo defecto, nuestro gestor de cuentas técnicas se pondrá en contacto con usted con un presupuesto de producción de proteínas personalizado. Tenga la seguridad de que nuestros servicios personalizados son igualmente de alta calidad y competitivos que nuestros servicios garantizados.

Nuestros representantes de atención al cliente están disponibles las 24 horas del día, de lunes a viernes, para ayudarle.