Enzimas y componentes claveEditar
El proceso de recombinación V(D)J está mediado por la recombinasa VDJ, que es un conjunto diverso de enzimas. Las enzimas clave implicadas son los genes activadores de la recombinación 1 y 2 (RAG), la desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) y la nucleasa Artemis, un miembro de la ubicua vía de unión de extremos no homólogos (NHEJ) para la reparación del ADN. Se sabe que hay otras enzimas implicadas en el proceso, como la proteína quinasa dependiente del ADN (DNA-PK), la proteína complementaria cruzada de reparación de rayos X 4 (XRCC4), la ADN ligasa IV, el factor de unión de extremos no homólogos 1 (NHEJ1; también conocido como Cernunnos o factor similar a XRCC4), el recientemente descubierto Paralog de XRCC4 y XLF (PAXX), y las ADN polimerasas λ y μ. Algunas enzimas implicadas son específicas de los linfocitos (por ejemplo, RAG, TdT), mientras que otras se encuentran en otros tipos de células e incluso de forma ubicua (por ejemplo, los componentes de NHEJ).
Para mantener la especificidad de la recombinación, la recombinasa V(D)J reconoce y se une a las secuencias de señal de recombinación (RSS) que flanquean los segmentos de genes variables (V), de diversidad (D) y de unión (J). Las RSS se componen de tres elementos: un heptámero de siete nucleótidos conservados, una región espaciadora de 12 o 23 pares de bases de longitud, y un noámero de nueve nucleótidos conservados. Aunque la mayoría de los RSS varían en su secuencia, las secuencias consensuadas del heptámero y el noámero son CACAGTG y ACAAAAACC, respectivamente; y aunque la secuencia de la región espaciadora está poco conservada, su longitud está muy conservada. La longitud de la región espaciadora corresponde aproximadamente a una (12 pares de bases) o dos vueltas (23 pares de bases) de la hélice de ADN. Siguiendo lo que se conoce como la Regla 12/23, los segmentos de genes que se recombinan suelen ser adyacentes a RSSs de diferentes longitudes de espaciador (es decir, uno tiene un «12RSS» y otro un «23RSS»). Esta es una característica importante en la regulación de la recombinación V(D)J.
ProcessEdit
La recombinación V(D)J comienza cuando la recombinasa V(D)J (a través de la actividad de RAG1) se une a un RSS que flanquea un segmento del gen codificador (V, D o J) y crea una mella de una sola hebra en el ADN entre la primera base del RSS (justo antes del heptámero) y el segmento codificador. Esta operación es energéticamente neutra (no necesita hidrólisis de ATP) y da lugar a la formación de un grupo hidroxilo 3′ libre y un grupo fosfato 5′ en la misma cadena. El grupo hidroxilo reactivo es posicionado por la recombinasa para atacar el enlace fosfodiéster de la hebra opuesta, formando dos extremos de ADN: una horquilla (stem-loop) en el segmento codificador y un extremo romo en el segmento señal. El modelo actual es que el mellado del ADN y la formación de la horquilla se producen en ambas hebras simultáneamente (o casi) en un complejo conocido como centro de recombinación.
Los extremos romos de la señal se ligan al ras para formar un trozo circular de ADN que contiene todas las secuencias intermedias entre los segmentos codificantes conocido como unión de señal (aunque de naturaleza circular, no debe confundirse con un plásmido). Aunque originalmente se pensaba que se perdía durante las sucesivas divisiones celulares, hay pruebas de que las uniones de señal pueden volver a entrar en el genoma y dar lugar a patologías al activar oncogenes o interrumpir la(s) función(es) de los genes supresores de tumores.
Los extremos codificantes se procesan aún más antes de su ligadura mediante varios eventos que finalmente conducen a la diversidad de uniones. El procesamiento comienza cuando la DNA-PK se une a cada extremo roto del ADN y recluta a varias otras proteínas, entre ellas Artemis, XRCC4, la ADN ligasa IV, Cernunnos y varias ADN polimerasas. La DNA-PK forma un complejo que conduce a su autofosforilación, lo que resulta en la activación de Artemis. Las horquillas del extremo codificador se abren por la actividad de Artemis. Si se abren en el centro, se producirá un extremo de ADN romo; sin embargo, en muchos casos, la apertura está «descentrada» y da lugar a que queden bases extra en una hebra (un saliente). Estos se conocen como nucleótidos palindrómicos (P) debido a la naturaleza palindrómica de la secuencia producida cuando las enzimas de reparación del ADN resuelven el saliente. El proceso de apertura de la horquilla por parte de Artemis es un paso crucial de la recombinación V(D)J y es defectuoso en el modelo de ratón de inmunodeficiencia combinada severa (scid).
A continuación, XRCC4, Cernunnos y DNA-PK alinean los extremos del ADN y reclutan a la desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT), una ADN polimerasa independiente de la plantilla que añade nucleótidos no templados (N) al extremo codificador. La adición es mayoritariamente aleatoria, pero la TdT muestra una preferencia por los nucleótidos G/C. Como todas las ADN polimerasas conocidas, la TdT añade nucleótidos a una hebra en dirección 5′ a 3′.
Por último, las exonucleasas pueden eliminar bases de los extremos codificantes (incluyendo cualquier nucleótido P o N que se haya formado). Las ADN polimerasas λ y μ insertan entonces los nucleótidos adicionales que sean necesarios para que los dos extremos sean compatibles para su unión. Este es un proceso estocástico, por lo que puede ocurrir cualquier combinación de adición de nucleótidos P y N y de eliminación exonucleolítica (o ninguna). Finalmente, los extremos codificantes procesados son ligados por la ADN ligasa IV.
Todos estos eventos de procesamiento dan como resultado un paratopo que es muy variable, incluso cuando se recombinan los mismos segmentos del gen. La recombinación V(D)J permite la generación de inmunoglobulinas y receptores de células T para antígenos que ni el organismo ni su(s) ancestro(s) necesitan haber encontrado previamente, lo que permite una respuesta inmune adaptativa a los nuevos patógenos que se desarrollan o a los que cambian con frecuencia (por ejemplo, la gripe estacional). Sin embargo, una advertencia importante de este proceso es que la secuencia de ADN debe permanecer dentro del marco para mantener la secuencia correcta de aminoácidos en el producto proteico final. Si la secuencia resultante está fuera del marco, el desarrollo de la célula se detendrá y ésta no sobrevivirá hasta la madurez. La recombinación V(D)J es, por tanto, un proceso muy costoso que debe ser (y es) estrictamente regulado y controlado.