Resolución axial

1.43.2 El caso de las técnicas de microscopía de superresolución

Las resoluciones lateral y axial en el microscopio de luz están fundamentalmente limitadas por la difracción en la relación entre la longitud de onda de la luz y la apertura, o ángulo de aceptación, de la lente objetivo utilizada para la obtención de imágenes, tal y como describió Ernst Abbe en 1873. En la dimensión lateral, este límite de resolución es de aproximadamente 200 nm, y en la dimensión axial el límite es de aproximadamente 500 nm. El límite de difracción de la microscopía óptica proviene de las limitaciones fundamentales de la óptica utilizada en la formación de imágenes. Si consideramos la imagen formada por una fuente de luz esférica de subresolución, nos encontramos con que la imagen que resulta de una óptica de microscopio, incluso perfectamente corregida y libre de aberraciones, no se describe mediante una simple esfera. De hecho, se observa una compleja distribución de intensidad 3D en el punto focal, y esta distribución de intensidad 3D puede describirse matemáticamente mediante la función de dispersión de puntos (PSF) (Figura 1). El máximo central de la PSF contiene el 86,5% de la intensidad energética total disponible. Tanto en la dimensión lateral como en la axial, la intensidad de energía restante se mapea en una serie de máximos y mínimos de forma rotacionalmente simétrica. Es la interacción de las PSF de características de imagen adyacentes lo que determina en última instancia el límite de resolución de difracción del microscopio de luz.

Figura 1. Mapas de intensidad XY (a) y XZ (b) de una función de dispersión de puntos ideal.

Cuando dos objetos se acercan el uno al otro en el espacio, sus PSFs se superponen y pronto los dos objetos no pueden ser discriminados el uno del otro. Se ha descrito que el solapamiento mínimo de dos PSF que se puede tolerar antes de que se pierda la capacidad de distinguir uno de otro es el punto en el que la intensidad cae aproximadamente un 25% entre las dos PSF. El punto en el que se alcanza esta caída de intensidad equivale a la distancia entre el máximo central y el primer mínimo de la PSF. Es muy difícil determinar con exactitud esta distancia, ya que es difícil posicionar el mínimo con precisión, y en su lugar se utiliza la media anchura máxima (FWHM) del máximo central de la PSF.

A partir de ambas ecuaciones, vemos que las resoluciones lateral y axial dependen de la apertura numérica del sistema óptico que recoge la luz y de la longitud de onda de la propia luz. La mejora del poder de resolución proviene del uso de lentes de objetivo de alta apertura numérica y de longitudes de onda más cortas de la luz. Otros factores, como el brillo relativo de los dos objetos (contraste), influyen en esta distancia mínima de resolución. En términos prácticos, en la obtención de imágenes con microscopios, se necesita tanto una apertura numérica óptica como un contraste suficientes para poder ver con precisión los detalles subcelulares.

Bajar la longitud de onda de la iluminación al rango ultravioleta para mejorar la resolución limita las opciones de las sondas fluorescentes y empuja los límites de las correcciones ópticas y las propiedades de transmisión de la trayectoria óptica del microscopio. Otras complicaciones provienen del uso de la iluminación ultravioleta en estudios de células vivas, donde muchos investigadores han observado los efectos nocivos de estas longitudes de onda en la viabilidad celular a largo plazo. Los diseños ópticos modernos han mejorado las aperturas numéricas de las lentes, aunque la mejora real en este sentido sólo se ha producido con el uso de medios de montaje exóticos y materiales de vidrio de cobertura. Ambas estrategias no consiguen más que una modesta mejora de la resolución y son poco prácticas para el estudio de las células vivas.

La microscopía confocal biológica, que utiliza una apertura estenopeica para mejorar el contraste en el enfoque mediante la eliminación efectiva de la luz parásita de los planos de los objetos desenfocados, se ha convertido en una herramienta de imagen estándar en el estudio de las relaciones estructura-función celulares. La mejora en la visualización del plano de la imagen en foco permite alcanzar más fácilmente los límites prácticos de difracción de la resolución cuando el instrumento se ajusta críticamente. Teóricamente, con aperturas de agujeros de alfiler inferiores a 1 unidad Airy, las resoluciones lateral y axial mejoran realmente hasta un límite de 1,4 veces el del caso del microscopio de campo amplio. Sin embargo, en la práctica, los diámetros de los agujeros de alfiler inferiores a 1 unidad Airy proporcionan muy poca luz para la obtención de imágenes biológicas, ya que gran parte de la emisión enfocada es rechazada por el agujero de alfiler junto con la luz desenfocada no deseada. Para la obtención de imágenes biológicas, en las que normalmente se lucha por obtener la señal de emisión, el rechazo de una parte de esta señal limitada a cambio de una pequeña ganancia de resolución es poco práctico. De hecho, cuando la señal de emisión de la muestra es limitada, se suele optar por abrir el agujero de alfiler a diámetros superiores a 1 unidad Airy para recoger más señal a costa de un mayor grosor del corte óptico. Con estos diámetros de agujeros de alfiler, la resolución del microscopio confocal es esencialmente la misma que la de un microscopio fluorescente de campo amplio convencional.

Esto no quiere decir que no se puedan detectar objetos más pequeños que el límite de resolución: la detección incluso a nivel de moléculas individuales es posible, y ahora es relativamente sencilla utilizando las tecnologías de detección modernas. La eliminación completa de la iluminación directa que entra en el objetivo en la microscopía de campo oscuro crea un contraste excelente, de modo que incluso la pequeña cantidad de luz dispersada por objetos de difracción limitada, como los microtúbulos (25 nm de diámetro), se observa fácilmente. La microscopía de fluorescencia también proporciona excelentes condiciones de contraste que pueden permitir la observación y el registro de objetos que tienen dimensiones muy por debajo del límite de difracción de la resolución. Con la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF), el contraste se mejora con respecto a la microscopía de fluorescencia de campo amplio estándar al limitar la excitación axial a unos cientos de nanómetros de la interfaz fluido-cristal utilizando la energía de la luz evanescente de campo cercano para la excitación del fluoróforo. En estas condiciones, incluso la movilidad de una sola molécula puede seguirse en el tiempo dentro de una sección óptica muy fina. Sin embargo, ni la microscopía de campo oscuro ni la TIRF mejoran la resolución del sistema óptico: ambas técnicas se basan en grandes diferencias de contraste entre el objeto de interés y el fondo para permitir la detección por debajo de la resolución.

Superar los límites clásicos de resolución por difracción ha representado un gran reto en la microscopía óptica moderna. Los beneficios de mejorar nuestra capacidad de resolver detalles más finos del microscopio óptico son obvios. Una mayor resolución permitiría una descripción estructural más precisa de las organizaciones moleculares fundamentales para la fisiología y el comportamiento celular normal y anormal. Las disecciones moleculares y bioquímicas sólo llegan a revelar la complejidad de las organizaciones funcionales, como las que se encuentran en los contactos focales de adhesión. Poder visualizar directamente, con resoluciones cercanas a la dimensión molecular, estas organizaciones funcionales aumentaría sustancialmente nuestra comprensión de las interrelaciones moleculares y de los cambios de organización relacionados con estados funcionales o fisiológicos. Recientemente, varios investigadores han explotado varias estrategias diferentes para proporcionar mejoras sustanciales (de 2 a 10 veces o más) en los límites clásicos de resolución lateral y axial . Estas técnicas se dividen en dos categorías generales: las que se basan en cambios en la iluminación del espécimen, y las que utilizan estrategias de detección de una sola molécula junto con la dimensión temporal para construir una imagen superresuelta.

Para los fines de este artículo, se han elegido las técnicas que han dado lugar al desarrollo e introducción de instrumentos comerciales por parte de varios fabricantes. El uso de este criterio específico en la selección de los métodos que se discuten a continuación no debe interpretarse en modo alguno como un respaldo a estas técnicas sobre otras que se han introducido en la literatura. A medida que se desarrollen nuevos trabajos en este campo en rápida evolución, es posible que los nuevos métodos y enfoques superen a los que se describen a continuación. Sin embargo, la introducción de estos instrumentos comerciales en el mercado permite a una amplia gama de biólogos de diferentes disciplinas aplicar los métodos de superresolución a sus propias cuestiones biológicas específicas, sacando estos métodos de los laboratorios de desarrollo especializados. Se anima a los lectores a investigar por sí mismos las imágenes de alta calidad contenidas en el material complementario en línea que acompaña a muchos de los artículos referenciados.