Respuestas celulares y moleculares al tratamiento agudo con cocaína en células N2a de tipo neuronal: mecanismo potencial para su resistencia en la muerte celular

Materiales

Cultivo celular

Las células N2a (CCL-131, ATCC) se mantuvieron como un cultivo en monocapa48, y se ha empleado ampliamente para estudios sobre sustancias de abuso14,49,50 o trastornos del SNC como las enfermedades de Parkinson51 o Alzheimer47,52,53. Una de las ventajas de esta línea celular es que los finos cambios morfológicos debidos a cualquier exposición química pueden detectarse fácilmente debido a su mayor tamaño celular. A menos que se especifique lo contrario, todos los experimentos de nuestro estudio se llevaron a cabo en medio RPMI-1640 libre de rojo de fenol y con un 10% de FBS. Las células postsembradas en placas o platos de cultivo se dejaron crecer 4-5 días en la incubadora para la diferenciación espontánea de los brotes de neuritas. Todos los estudios se repitieron al menos dos veces.

Morfología

Para las evaluaciones morfológicas brutas de las células, las células teñidas con violeta de cristal37 fueron fotomicrografiadas utilizando EVOS Cell Imaging Systems con objetivo ×40. En algunos estudios, la morfología o las vacuolas de las células teñidas con violeta de cristal se tomaron utilizando un microscopio Olympus IX-70 de contraste de fase invertido. Los brotes de neuritas se cuantificaron utilizando el software Image J (National Institutes of Health).

Electrofisiología

Se utilizó una pinza de parche de célula completa para registrar las células N2a cultivadas en cubreobjetos de plástico. Los cubreobjetos se lavaron tres veces con una solución de registro extracelular que contenía (en mM) 145 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 10 glucosa y 10 HEPES (312 mOsm, pH 7,4) y se incubaron en esta solución a temperatura ambiente. Los cubreobjetos se dejaron sin tratar o se trataron con 6,25 μM o 4 mM de cocaína directamente en la solución extracelular durante el registro. Los electrodos de vidrio (resistencia 1-5 MΩ) se llenaron con solución intracelular que contenía (en mM) 130 KCl, 2 NaCl, 10 HEPES y 5 EGTA (292 mOsm, pH 7,4). Las células se visualizaron bajo contraste de fase con un microscopio invertido Nikon Eclipse Ti-U y una cámara digital monocromática DS-Qi1 conectada.

Las grabaciones se realizaron con un amplificador Axopatch 200B (Molecular Devices, CA) y se digitalizaron con un sistema Digidata 1440A (Molecular Devices, CA). Las corrientes iónicas se registraron bajo un protocolo de pinza de voltaje (-60 a 135 mV en pasos de 15 mV, 250 ms de duración). Las corrientes postsinápticas espontáneas se registraron bajo una pinza de tensión continua a -80 mV durante 2 minutos. Se utilizó un protocolo de pinza de corriente (-100 a 200 pA en pasos de 20 pA, 800 ms de duración) para evaluar la capacidad de las células N2a de disparar potenciales de acción en respuesta a la inyección de corriente. Las señales se filtraron a 1 kHz y se muestrearon a 10 kHz. Los datos se recogieron y analizaron utilizando el software pCLAMP 10 (Molecular Devices, CA).

Tratamientos

Se disolvió una cantidad conocida de clorhidrato de cocaína en solución salina tamponada con fosfato (PBS) como reserva 1 M justo antes de los ensayos. Para simular las concentraciones farmacológicas in vivo de la cocaína, que van de 1 nM a 6,25 μM, se prepararon varios stocks de trabajo (0,04, 0,2, 0,4, 1, 2, 4, 8, 20, 40, 200 y 400 μM) en PBS; asimismo, para concentraciones más altas de cocaína (2, 3 y 4 mM finales), se prepararon stocks de trabajo de 80, 120 y 160 mM en PBS. A partir de cada stock de trabajo, se añadieron 5 μl de cocaína por pocillo para alcanzar las concentraciones deseadas y para evitar alteraciones del pH en el medio de cultivo37. El volumen final en cada pozo fue de 200 μl. Mientras que la selección de las concentraciones más bajas se basó en los informes de cocaína nano a micromolar inferior en células del SNC de adictos13, las concentraciones más altas se basaron en varios estudios in vitro14,15,16. Las células con el medio solo o con igual volumen de vehículo (PBS) en el medio sirvieron como controles, mientras que el medio desprovisto de células se tomó como blanco. Basándonos en nuestros estudios anteriores en células astrogliales C66, los tratamientos con cocaína en el presente estudio también se llevaron a cabo durante 1 h a efectos de comparación. Por cierto, el efecto de la cocaína en los adictos desaparece en este periodo para las cantidades y vías de ingesta típicas33. En un subconjunto de experimentos, las células en placas de 96 pocillos se pretrataron con 1 µM de YM155, un inhibidor del gen survivin, durante 30 minutos, seguido de un co-tratamiento con cocaína (2-4 mM) durante 1 h y se evaluó la viabilidad celular, mientras que en otros estudios, las células se pretrataron con 5 μM de PIK-75, un inhibidor de Nrf-224, durante 30 minutos antes del co-tratamiento con cocaína (2-4 mM) durante 1 h y se evaluó la viabilidad celular y los niveles de GSH.

Viabilidad y vacuolación

La viabilidad celular se evaluó mediante la captación de colorante violeta de cristal como se ha descrito previamente54,55. El grado de vacuolación en las células se cuantificó en las células fijadas con glutaraldehído mediante la captación de colorante rojo neutro como se ha descrito anteriormente56. El colorante se extrajo con etanol al 70% y ácido clorhídrico al 0,37%, y se tomó la absorbancia a 540 nm en un lector de placas. Las células teñidas con violeta de cristal se utilizaron para la fotomicrografía de las vacuolas utilizando un microscopio Olympus IX-70 de contraste de fase invertido con un objetivo de ×40.

Microscopía de vídeo

Para la videografía en vivo, se sustituyó uno de los objetivos oculares del microscopio Olympus IX-70 de contraste de fase invertido por un sistema de cámara de vídeo ocular estándar. La salida del conector de vídeo se conectó a un ordenador para la visualización de imágenes en el monitor utilizando el programa de software Electronic Ocular -R-AMCap, suministrado por Zhejiang JinCheng Scientific & Technology Co., Ltd, (HangZhou, China). La documentación de vídeo se tomó a una velocidad de 14 fotogramas por segundo.

Asunto de integridad de la membrana celular

La integridad de la membrana celular se determinó midiendo la liberación de LDH citoplasmática con el kit de ensayo no radiactivo CytoTox 96 (Promega, Madison, WI) según las instrucciones proporcionadas por el fabricante. En resumen, las células en placas de micropocillos de 96 pocillos se trataron con varias concentraciones de cocaína (2, 3 y 4 mM) durante 1 h. A continuación, se transfirieron 50 μl del medio de ensayo a una nueva placa de 96 pocillos, se mezclaron con un volumen igual de mezcla de sustrato del kit y se incubaron durante 30 minutos a 37 °C. La absorbancia se tomó en un lector de placas a 490 nm.

Medición de ROS intracelulares

Las células en placas de 96 pocillos se trataron con cocaína a 2, 3 y 4 mM durante 1 h, seguido de una tinción con un colorante permeable a las células H2DCFDA (10 μM final) durante 30 min6. Tras el lavado suave y el secado al aire de las células, se añadió PBS (100 μl/pocillo). Las placas se leyeron con el filtro de excitación ajustado a 485 nm y el filtro de emisión a 530 nm en un lector automático (BioTek™ Synergy HTX multimode micro plate reader, BioTek Instruments, Winooski, VT).

Ensayo de peroxidación lipídica

Las células se sembraron a una densidad inicial de 0,3 × 106 células por pocillo en placas de seis pocillos. La peroxidación lipídica se midió como se ha descrito anteriormente57. En resumen, tras el tratamiento con cocaína a 2, 3 y 4 mM durante 1 h, las células se cosecharon y se centrifugaron a 13.000 rpm en una microcentrífuga de mesa durante 6 minutos. Todos los pellets de células se sonicaron en PBS en hielo durante 3 s y se transfirieron a tubos de vidrio. A continuación, los lisados se mezclaron con ácido tricloroacético al 30% y ácido tiobarbitúrico (TBA) al 0,37%. La mezcla se hirvió durante 10 minutos, se enfrió a temperatura ambiente (TA), se transfirió a nuevos tubos Falcon y se centrifugó a 3038 × g durante 10 minutos. El sobrenadante claro se transfirió a una placa de 96 pocillos y se midió la absorbancia a 535 nm en un lector de microplacas. Se utilizó medio claro sin células como blanco.

Actividad metabólica mitocondrial general y potencial de membrana

Las células (2 × 104) se trataron con varias concentraciones de cocaína (2, 3 y 4 mM) durante 1 h en placas de microtitulación de 96 pocillos. A continuación, las placas se centrifugaron a 304 × g durante 4 minutos, y el medio que contenía cocaína se desechó cuidadosamente. Tras añadir inmediatamente medio fresco a las células (200 μl), se añadieron 10 μl de MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5(3-carboximetilfenol)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio, Promega) por pocillo, tal y como se informó anteriormente58 , y se incubaron durante 30 min a 37 °C. La absorbencia se tomó en un lector de microplacas a 490 nm. El potencial de la membrana se analizó según el procedimiento anterior46. Al final del tratamiento de 1 h con cocaína, las células en monocapa se cubrieron con 100 μl de glutaraldehído acuoso al 0,25% para su fijación, conteniendo Rh 123 para obtener una concentración final de 2,6 μM durante 30 min a RT. El sobrenadante se desechó, y las placas se lavaron con agua y se secaron al aire en la campana. Por último, se añadieron 100 μl de Triton×100 al 0,1% en PBS por pocillo y se incubaron a 37 °C durante 1 h. Las placas se leyeron con el filtro de excitación ajustado a 485 nm y el de emisión a 538 nm en un lector de microplacas multimodo BioTek™ Synergy™ HTX.

Detección de lactato

Los estudios realizados con células cultivadas en medio que contenía un 10% de FBS dieron altos valores de fondo debido a la interacción del suero con algunos de los componentes del kit (Trinity Biotech, Jamestown, NY). Por ello, en nuestros estudios posteriores, antes de los tratamientos, se sustituyó el medio que contenía un 10% de FBS por suero reducido (0,1% de FBS) en placas de microtitulación de 96 pocillos (2 × 104 células por pocillo). El reactivo del kit se disolvió en una solución cromogénica que consistía en 5,3 mM de ácido vanílico, 2,9 mM de 4-amino antipirina y unas 4 unidades de peroxidasa de rábano. Al cabo de 1 h de tratamiento con cocaína, el reactivo del kit se añadió directamente a los pocillos (20 μl por 200 μl) y las placas se mantuvieron en la incubadora a 37 °C para el desarrollo del color (5-10 min). La absorbancia de las células no tratadas se tomó como control, mientras que el medio desprovisto de células se tomó como blanco. La absorbancia se midió a 490 nm en un lector de microplacas.

Espectroscopia de RMN

La liberación de lactato de las células se detectó mediante espectroscopia de RMN de protones (1H+). Dado que la cantidad de suero no interfiere en este método, se utilizó un 10% de FBS en medio en placas de microtitulación de 96 pocillos (2 × 104 células/200 μl por pocillo). Al final de 1 h de tratamiento con cocaína, se agrupó el medio (0,15 ml por pocillo) de todas las réplicas (n = 12) de cada tratamiento (1,8 ml) en los tubos etiquetados. El medio de las células no tratadas se utilizó como control. Como las muestras tratadas contenían 2-4 mM de cocaína, añadimos cocaína (4 mM final) al medio en blanco. Los análisis de RMN se llevaron a cabo en el Bruker Avance 800 (\(\nu _0\) = 800,23 MHz) que está equipado con una criosonda TCI 800S6 H-C/N-D-05 Z (la fuerza máxima del gradiente de campo z es de 48 G/cm). Para obtener un espectro de RMN unidimensional (1D), se adquirieron 16 transitorios y se sumaron con 3 s de retraso en la adquisición. Se emplearon 32.000 puntos de datos para obtener una anchura espectral de 7500 Hz. El pico de agua dominante situado a 4,75 ppm en el espectro se eliminó utilizando la secuencia de pulsos WATERGATE W520. Se dio un ancho de banda de 3000 Hz a lo largo de cada lado del pico de agua como ventana espectral para observar los picos de soluto empleando un tiempo de retardo de 333,3 μs para los trenes de pulsos WATERGATE. Se preparó un estándar externo, una solución acuosa de DMSO de 3,3 mM, para la cuantificación del lactato en la solución de la muestra.

Medición del H2S en el medio de cultivo celular

Las células se sembraron a una densidad inicial de 2 × 104 por pocillo en placas de 96 pocillos. Antes del tratamiento con cocaína, se añadió a las células acetato de zinc acuoso al 1,64%59,60 (final: 0,041%) para convertir el gas volátil H2S en sulfuro de zinc durante el tratamiento con cocaína. Después de 1 hora de tratamiento con 2, 3 y 4 mM de cocaína, se añadieron 17,453 mM de sulfato de N,N-dimetil-p-fenilendiamina en HCl 7,2 M (final: 2,55 mM) y 26,18 mM de FeCl3 en HCl 1,2 M (final: 3,83 mM) a los pocillos y se agitó suavemente. Las burbujas del medio se eliminaron añadiendo 5 μl de etanol frío a todos los pocillos justo antes de leer las placas a 670 nm en un lector de microplacas.

Asunto de bioluminiscencia del ATP

Las células de las placas de microtitulación de 96 pocillos se trataron con varias concentraciones de cocaína (2, 3 y 4 mM) durante 1 h. El ATP total se midió utilizando el kit de ensayo bioluminiscente de ATP en células somáticas (FLASC, Sigma-Aldrich) según las instrucciones del kit suministradas por el fabricante. En resumen, al final del tratamiento, se añadieron 75 μl de solución liberadora de ATP de células somáticas por pocillo para lisar las células. A continuación, se transfirieron 50 μl de lisado a nuevas placas de 96 pocillos de fondo blanco y transparente, que ya contenían 50 μl de enzima de ensayo de ATP bajo luz reducida. La luminiscencia se midió inmediatamente en un lector de microplacas multimodo BioTek™ Synergy™ HTX.

Aislamiento de ARN y síntesis de ADNc

Las células se sembraron a una densidad de 2 × 106 en placas de cultivo de 100 mm de diámetro. En el momento del tratamiento, las células alcanzaron alrededor del 65-70% de confluencia. Tras 1 h de tratamiento con 2-4 mM de cocaína, las células se cosecharon por raspado y se centrifugaron a 1125 × g durante 5 min. El ARN total se aisló según el protocolo suministrado por el fabricante (Qiagen Sciences, German town, MD) utilizando columnas RNeasy mini spin. Se realizó un tratamiento con DNasa I (Qiagen Sciences) en la columna. El ARN total de la columna se eluyó con 20 μl de agua libre de RNasa. Para la cuantificación, el ARN en hielo se diluyó en agua libre de RNasa en proporción 1:10. La cantidad de ARN total se midió con el espectrofotómetro Nanodrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). El ARN mostró una relación de >1,95 a 260/280 nm, y se utilizó posteriormente para la síntesis de ADNc. Se utilizó un microgramo de ARN total para producir ADNc utilizando un kit de síntesis de ADNc iScript (Bio-Rad, Hércules, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Expresión relativa mediante RT-PCR cuantitativa

El análisis de la expresión génica de Nrf-2, survivina (Birc5) y GAPDH mediante qPCR se realizó en un termociclador iCycler con sistema de detección MyiQ (Bio-Rad) utilizando la supermezcla iQ SYBR Green. Los productos de Nrf-2, survivina y GAPDH se sintetizaron mediante reacciones de PCR separadas, realizadas en 20 μl de volumen final con 2 μl de muestra de ADNc y 500 nM de cebadores específicos. Las condiciones de ciclado fueron las siguientes: 95 °C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 °C durante 15 s, 55 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s, mientras que el análisis de la curva de fusión tras la PCR se realizó a 55-95 °C. La cuantificación relativa de las expresiones génicas se realizó según el método 2-△△CT61 con GAPDH como control endógeno. Las secuencias de cebadores utilizadas para los análisis se muestran en la Tabla 1.

Ensayo de GSH total

Después de tratar con diferentes concentraciones de cocaína (2-4 mM) en medio completo durante 1 h en placas de microtitulación de 96 pocillos, las células se fijaron con glutaraldehído al 0,25% durante 30 min, seguido de un lavado suave tres veces, y se secaron al aire. El GSH celular total se analizó como se ha descrito anteriormente62. La absorbancia se midió a 412 nm en un lector de microplacas.

Preparación de lisados de células enteras

Para los ensayos enzimáticos, se sembraron células a una densidad de 2 × 106 en placas de cultivo de 100 mm de diámetro. Tras 1 h de tratamiento con 2-4 mM de cocaína, las células se cosecharon utilizando raspadores celulares. Tras centrifugarlas a 1620 × g durante 5 minutos, los gránulos celulares se almacenaron a -70 °C hasta su uso posterior. El día de los ensayos, los pellets se volvieron a suspender en 0,5 ml de PBS y se sonicaron dos veces en hielo durante 15 s. El contenido se transfirió a tubos eppendorf y se microcentrifugó a 5000 rpm durante 5 min. Los sobrenadantes se transfirieron a nuevos tubos y se utilizaron para los ensayos enzimáticos. La concentración de proteínas en cada lisado se determinó utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA (Pierce, Rockford, IL) según las instrucciones del fabricante, tomando la albúmina de suero bovino como referencia estándar.

El ensayo de catalasa

Se ensayó según el método anterior63. La mezcla de reacción (450 μl) en una cubeta de cuarzo contenía 50 μl de lisado celular (60 μg), 250 μl de tampón fosfato 50 mM (pH 7,0). La reacción se inició con la adición de 150 μl de H2O2 30 mM (10 mM final). La disminución de la absorbancia a 240 nm se controló durante 2 minutos en un espectrofotómetro Genesys 10 S UV-Vis (Thermo Scientific, Vernon Hills, IL). La actividad enzimática se calculó utilizando el coeficiente de extinción de 0,00706 por mmol por mm y la unidad de actividad enzimática se expresó como mmol de H2O2 descompuesto por minuto por mg de proteína. A continuación, la actividad enzimática de las muestras tratadas se comparó con el control (100%).

Ensayo de GPx

Se ensayó según el procedimiento publicado64. La mezcla de reacción (500 μl) contenía 1 mM de GSH, 0,15 mM de NADPH, 0,12 unidades de glutatión reductasa (GR), 0,1 mM de azida sódica en fosfato potásico 0,1 M (pH 7,0 con 1 mM de EDTA. Se añadió azida sódica a la mezcla de reacción para inhibir la actividad de la catalasa endógena. La mezcla de reacción se incubó con 60 μg de muestra durante 10 min sin NADPH, y la reacción se inició con la adición de NADPH y H2O2 a una concentración final de 150 μM. La tasa de consumo de NADPH se monitorizó a 340 nm durante 3 min. Una unidad de actividad de GPx se definió como la cantidad de enzima necesaria para consumir 1 μmol de NADPH/min en el ensayo acoplado y la actividad se expresó por mg de proteína. A continuación, la actividad enzimática de las muestras tratadas se comparó con el control (100%).

Análisis estadístico

Los resultados experimentales (n = número de pozos agrupados de al menos dos experimentos diferentes) se presentaron como la media ± SEM. Todos los gráficos de barras se trazaron utilizando el software GraphPad Prism, versión 3.00 (San Diego, CA). Se analizó la significación de los datos mediante un ANOVA de una vía y luego se compararon mediante las pruebas de comparación múltiple de Dunnett o Bonferroni. Los valores de prueba de P < 0,05 y P < 0,01 se consideraron significativos y altamente significativos, respectivamente.