RNasa A: Preguntas frecuentes | AG Scientific Blog

Introducción a la RNasa

Las ribonucleasas (RNasas) son un gran grupo de enzimas hidrolíticas que degradan las moléculas de ácido ribonucleico (ARN). Son nucleasas que catalizan la descomposición del ARN en componentes más pequeños. Son una superfamilia de enzimas que catalizan la degradación del ARN, operando en los niveles de transcripción y traducción.

Conformación 3D de la enzima ribonucleasa A

Estas enzimas están presentes en todas las células vivas y fluidos biológicos, incluyendo procariotas y eucariotas, y realizan muchas funciones importantes. Las RNasas son ubicuas, con una vida útil muy corta en un entorno no protegido. Los efectos citotóxicos incluyen la escisión del ARN que conduce a la inhibición de la síntesis de proteínas y a la inducción de la apoptosis. Estos efectos citotóxicos pueden producirse aplicando la RNasa a la superficie exterior de la célula, pero se ha descubierto que la citotoxicidad se multiplica por 1000 cuando la enzima se introduce artificialmente en el citosol, lo que indica que la internalización en la célula es el paso que limita la tasa de toxicidad.

Las RNasas se clasifican en endorribonucleasas y exorribonucleasas. Las endorribonucleasas son las formas A, P, H, I, III, T1, T2, U2, V1, PhyM y V.

Las exorribonucleasas incluyen las formas de RNasa PH, II, R, D y T, así como la polinucleótido fosforilasa (PNPasa), la oligorribonucleasa, la exorribonucleasa I y la exorribonucleasa II. Estas enzimas escinden varias especies de ARN de forma diferente.

Recientemente, los investigadores han prestado atención a las RNasas como posibles agentes para el tratamiento del cáncer. La idea es encontrar una enzima que dañe selectivamente las células cancerosas sin afectar a las células normales circundantes.

Productos de RNasa A de AG Scientific, Inc.

Preguntas frecuentes sobre la RNasa A

¿Qué es la RNasa A?

La ribonucleasa A es una enzima digestiva secretada por el páncreas que «digiere» o hidroliza específicamente los polímeros de ARN (pero no de ADN) mediante la escisión por endonucleasa de los enlaces fosfodiéster que forman los enlaces covalentes entre los residuos de ribonucleótidos adyacentes en estas moléculas.

¿Qué significa la «A» en la RNasa A?

La «A» de su nombre no se refiere a su especificidad de sustrato, sino a la forma predominante de la enzima producida por el páncreas bovino. La RNasa A no está modificada, mientras que la RNasa B, la RNasa C y la RNasa D son mezclas de glicoformas.

Debido a su disponibilidad en gran cantidad y a su alta pureza, la RNasa A ha sido objeto de trabajos de referencia en la química de las proteínas y la enzimología. Además, las variantes citotóxicas y los homólogos de la enzima han demostrado su utilidad como agentes quimioterapéuticos.

¿Cuál es la historia de esta enzima?

Fue utilizada por Christian Anfinsen para demostrar que la secuencia de aminoácidos, determina la estructura de una proteína plegada y fue utilizada por Stanford Moore y William Stein para demostrar que se utiliza una disposición específica de aminoácidos en el centro catalítico de las enzimas.

La ribonucleasa A fue también la primera enzima sintetizada por R. Bruce Merrifield, demostrando que las moléculas biológicas son simples entidades químicas que pueden construirse artificialmente. Todos estos conceptos centrales, descubiertos con la ayuda de la ribonucleasa, fueron galardonados con los premios Nobel.

¿Cuál es la estructura de la RNasa A?

Estructura de la RNasa

La relativamente pequeña secuencia de 124 aminoácidos de la RNasa A, que tiene una masa molecular de 12.600 Da., contiene cuatro residuos His, dos de los cuales, His12 e His119, están directamente implicados como residuos catalíticos de esta enzima. El anillo de imidazol de His12 tiene un valor pK anónimamente bajo (pK < 6,0), lo que sugiere que debe estar desprotonado para la catálisis. A la inversa, el anillo de imidazol de His119 tiene un valor pK anónimamente alto (pK > 6,0), lo que sugiere que debe estar protonado para la catálisis.

¿Es la Ribonucleasa A una proteína?

La RNasa A es una proteína pequeña, la enzima madura sólo tiene 124 residuos de aminoácidos, sin ningún carbohidrato unido. A diferencia de otras enzimas, la RNasa A contiene 19 de los 20 ácidos, faltando sólo el triptófano.

¿Cuál es el mecanismo de acción?

His12 actúa como una base general, aceptando el protón 2′-OH del anillo de azúcar ribonucleico sésil. Esto promueve un ataque nucleofílico del 2′-O sobre el átomo de fósforo (P) más cargado positivamente, creando así un intermedio de fosfato de ribonucleótido 2′-,3′-cíclico. La creación de este intermedio es facilitada por el imidazol de His119 que actúa como un ácido general, donando su protón al átomo de oxígeno en el enlace susceptible P-O-R’.

Para el segundo paso de la reacción, las actividades generales de ácido y base de las cadenas laterales de estos dos residuos His se invierten. El His12 actúa como un ácido general, donando su protón recién adquirido al intermedio ribonucleótido fosfato 2′-,3′-cíclico, mientras que el His119 que actúa como una base general, aceptando un protón del agua para promover el ataque hidroxilo sobre el mismo intermedio 2′-,3′-cíclico.

¿Cuál es el sitio de corte de la RNasa A?

La RNasa A hidroliza eficientemente los contaminantes de ARN en las preparaciones de ADN cortando el enlace fosfodiéster entre el grupo 3′-fosfato de un nucleótido de pirimidina (C y U) y la 5′-ribosa de su nucleótido adyacente 1, 2, 3. El fosfodiéster intermedio 2′-,3′–cíclico que se genera se hidroliza posteriormente a un grupo 3′- monofosfato. La RNasa A pancreática bovina es una proteína muy estable de 124 aminoácidos con su mayor actividad medida hacia el ARN monocatenario y una tasa de escisión dos veces más rápida en los residuos de citidina en comparación con los residuos de uridilo.

¿Cuál es la reacción de catálisis ácido/base de la RNasa A?

La RNasa A también utiliza la catálisis ácido/base para cambiar químicamente sus sustratos. Los residuos ácidos o básicos de la enzima transfieren protones hacia o desde el reactivo para estabilizar las cargas en desarrollo en el estado de transición. La transferencia de protones suele crear mejores grupos de salida, haciendo que la reacción sea energéticamente más favorable.

La histidina es un residuo de aminoácido muy común que participa en la catálisis, ya que la histidina tiene un valor pKa cercano al neutro, (pKa=6); por lo tanto, la histidina puede tanto aceptar como donar protones a pH fisiológico.

¿Cuál es la estabilidad de la ribonucleasa A?

La ribonucleasa A es sorprendentemente estable. Por ejemplo, en un procedimiento para purificar la ribonucleasa A del páncreas de vaca, los extractos se tratan con ácido sulfúrico y luego se calientan casi hasta la ebullición, y la ribonucleasa A es lo único que sobrevive. Esto no es sorprendente, ya que es secretada por el páncreas y necesita realizar su trabajo en el entorno inhóspito del tracto digestivo. La estabilidad de la ribonucleasa A se debe en gran parte a los cuatro puentes disulfuro que unen las diferentes partes de la cadena.

En general, para mantener la estabilidad, almacene y manipule el producto según las instrucciones del vendedor.

¿Cómo se inactiva la RNasa A?

La RNasa A es una enzima bastante estable y contiene 4 puentes disulfuro, que se dan en todas las ribonucleasas pancreáticas de los mamíferos. Cuando los puentes se rompen reductivamente, la proteína se desnaturaliza y se vuelve inactiva. En la reoxidación, la proteína se repliega y se restablece la actividad completa. Sin embargo, es posible reducir los puentes sólo parcialmente y conservar la actividad enzimática. La eliminación de 4 péptidos en el extremo carboxilo destruye la actividad enzimática.

¿Qué inhibe la RNasa A?

El vanadato de uridina es un potente inhibidor competitivo de la RNasa A. Lo que lo hace tan potente es el hecho de que su estructura imita un estado de transición que es intermedio en la reacción.

¿Cómo se prepara la RNasa A a partir de un stock?

La RNasa A se prepara normalmente hirviendo el stock durante 10 minutos para eliminar la actividad de la DNasa contaminante sin afectar a la RNasa. Calentarlo a 65°C no afectará a las RNasas.

¿Cómo reconstituir el stock preparado de RNasa A?

La RNasa A puede disolverse a una concentración de 1 a 10 mg/ml en 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 15 mM NaCl, se calienta a 100°C durante 15 minutos para inactivar las DNasas contaminantes y se enfría lentamente a temperatura ambiente y se dispensa en alícuotas.

¿Cuál es la concentración de trabajo de esta enzima?

La concentración de trabajo recomendada de la RNasa A es de 1 a 100 µg/mL dependiendo de la aplicación. La enzima es activa en una amplia gama de condiciones de reacción. A bajas concentraciones de sal (0 a 100 mM de NaCl), la RNasa A escinde el ARN monocatenario y bicatenario, así como la cadena de ARN en los híbridos de ARN-ADN.

¿Cuál es la temperatura de almacenamiento y las medidas de manipulación de este producto?

Almacenar en un vial bien cerrado a -20ºC. Una vez abierto, deshidratarlo sobre gel de sílice al vacío antes de devolverlo a -20ºC. Tener precaución al manipularlo. No utilice este compuesto si no está totalmente capacitado o no es consciente de los peligros que conlleva.

¿Cuáles son las aplicaciones de la RNasa A?

Las RNasas tienen papeles importantes en la degradación y el recambio del ARN en todos los organismos. La enzima ribonucleasa puede desenrollar la hélice de ARN formando un complejo con el ARN monocatenario.

La RNasa A es una endorribonucleasa con funciones en el metabolismo del ARN y la regulación de la expresión génica.

Se ha descubierto que la RNasa A desempeña papeles importantes en enfermedades como las autoinmunes, las insuficiencias renales y los trastornos del páncreas. Más recientemente, también se informó de la actividad antitumoral de una RNasa A con propiedades citotóxicas y citostáticas. Los miembros de la superfamilia de la RNasa A se expresan ampliamente y están presentes en el suero y los tejidos de los mamíferos.

La enzima puede utilizarse para hidrolizar el ARN de las muestras de proteínas. Es compatible para su uso en ensayos de protección de RNasas, para eliminar ARN unido de forma inespecífica, en el análisis de secuencias de ARN, para hidrolizar ARN contenido en muestras de proteínas y en la purificación de ADN.

¿Cuál es el aspecto/forma de este producto?

Se suministra como un polvo blanco purificado por cromatografía, libre de sal y liofilizado. El aspecto/forma del producto puede variar según el fabricante.

Lectura adicional

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