Sistema de administración de fármacos mediante hidrogeles Pluronic F-127 de doble respuesta (pH/temperatura) para terapia transdérmica basada en textiles

Caracterización de TMC y PEG-HA

Los espectros 1H-NMR de TMC y quitosano se muestran en la Fig. 2A, donde el quitosano mostró picos a 2,68 ppm para H-2 y múltiples picos en el rango de 3,85-3,55 ppm para H-3 a H-6. El pico para el grupo N-trimetil (-NMe3) del TMC se detectó a 3,36 ppm confirmando la presencia de N-metilación y refiriéndose a sitios cuaternizados. Junto con la producción de TMC por N-metilación de un paso, se sintetizó un derivado de quitosano modificado con NMe2 (2,28 ppm) como producto secundario.

Espectro de RMN de 1H de quitosano y TMC (A); HA y PEG-HA (B).

Como se muestra en la Fig. 2B, la HA mostró un pico a 3,21 ppm para el H glucosídico y un pico de H etil a 1,89 ppm. La HA tras la reacción con OMe-PEG2000-NH2 mostró un pico de H etileno (3,60 ppm) y el pico de H (-NH-CH2-CH2-O-) (2,76 ppm) de OMe-PEG2000-NH2, lo que indica que el PEG-HA se formó con éxito mediante una reacción de acoplamiento de amidas (Fig. 2B). Otros picos del PEG-HA son muy similares a los de la HA.

Los espectros FT-IR del quitosano y del TMC se muestran en la Fig. 3A. El TMC mostró picos característicos: Estiramiento O-H/N-H (3431 cm-1); estiramiento C-H, anillo de piranosa (2919 cm-1); estiramiento C=O, amida de NH-Ac (1654 cm-1); estiramiento C-H, metilo de TMC (1503 cm-1); flexión C-H, CH3CO (1390 cm-1); y estiramiento C-O-C (1158, 1066 cm-1). La figura 3A muestra que los picos espectrales del quitosano son similares a los del TMC. El quitosano mostró un estiramiento O-H/N-H a 3421 cm-1, un estiramiento C-H del anillo de piranosa a 2880 cm-1, un estiramiento C=O de la amida del NH-Ac a 1654 cm-1, una flexión C-H del CH3CO a 1390 cm-1, y un estiramiento C-O-C a 1155 y 1078 cm-1. El pico a 1503 cm-1 para los enlaces C-H de los grupos metilo en TMC corresponde a la adición de grupos trimetilo a los grupos amina del quitosano.

Espectro FTIR de quitosano y TMC (A); HA y PEG-HA (B).

Los picos FTIR característicos del PEG-HA mostrados en la Fig. 3B son el estiramiento O-H (3428 cm-1), el estiramiento C-H, el anillo de piranosa (2892 cm-1), el estiramiento C=O, el NH-Ac (1644 cm-1) y el estiramiento C-N (1473 cm-1). La HA mostró picos característicos similares a los del PEG-HA y los picos espectrales de la HA son el estiramiento O-H (3438 cm-1); el estiramiento C-H, anillo de piranosa (2899 cm-1); y el estiramiento C=O, NH-Ac (1615 cm-1). El pico encontrado a 1473 cm-1 para el PEG-HA indica el acoplamiento de la amida de la HA con el OMe-PEG2000-NH2.

Análisis de la viscosidad dinámica y resultados de la inversión del tubo (termorrespuesta de las formulaciones de hidrogeles)

En este estudio, los valores de la viscosidad dinámica de las formulaciones se midieron en función de la temperatura con una velocidad de cizallamiento fija de 85 s-1, y la conversión de la fase sol a la fase gel con la temperatura se representa en la Fig. 4I. Los valores de viscosidad dinámica (Pa.s) de las formulaciones de hidrogel cargadas con ácido gálico PF127/TMC/PEG-HA y PF127 cambiaron gradualmente con el aumento de la temperatura en el rango de 5-50 °C, y desde el punto de inflexión, ambas formulaciones mostraron claramente una transición sol-gel a 37 °C. Además, el contenido de PF127 de ambas formulaciones era del 13,5 % en peso del peso total de las formulaciones de hidrogel, y ambas muestras mostraron una temperatura de gelificación de 37 °C. Los valores de viscosidad dinámica de los hidrogeles PF127/TMC/PEG-HA y PF127 a 37 °C fueron de 7,02 Pa.s y 5,6 Pa.s, respectivamente. El mayor valor de viscosidad dinámica de PF127/TMC/PEG-HA que el de PF127 a 37 °C se debió a la adición de TMC y PEG-HA en el sistema de hidrogeles basado en PF127 y que creó mayores interacciones inter-micelares aumentando la hidrofobicidad de todo el sistema1. Además, el mayor valor de viscosidad dinámica del hidrogel PF127/TMC/PEG-HA en el punto de gelificación sugería una mejor resistencia a la deformación bajo tensión. En la literatura, se informa de que el PF127 actúa como un fluido no newtoniano en la fase de gel (37 °C) y los valores de viscosidad dinámica varían en función de la velocidad de cizallamiento52. El PF127 en la fase sol se comportó como un fluido newtoniano52. En el presente estudio, los valores de viscosidad dinámica de las formulaciones en fase sol a 5 °C fueron de 0,40 Pa.s y 0,32 Pa.s para PF127/TMC/PEG-HA y PF127, respectivamente, que están en buen acuerdo con los valores reportados previamente en la literatura52.

Se aplicó el método de inversión de tubo para visualizar la gelificación con el cambio de temperatura midiendo la fluidez de PF127/TMC/PEG-HA y el sistema mostró una gelificación reversible con una transición sol-gel a 37 °C. Las cadenas de PF127 junto con otros dos compuestos (TMC y PEG-HA) utilizan la temperatura como desencadenante y forman hidrogeles mediante la unión física reversible de las cadenas poliméricas53. Los hidrogeles vuelven al estado de solución después de eliminar el estímulo térmico. La agregación intermicelar de los polímeros termorresistentes cerca de la temperatura de gelificación muestra un cambio de entropía positivo (ΔS) y un cambio de energía libre negativo (ΔG) de agregación54. Las asociaciones agua-agua provocan un aumento de entropía conocido como efecto hidrofóbico, que es la fuerza que guía la formación del gel a la LCST54.

Estudio reológico

Los parámetros reológicos de las formulaciones, a saber, la viscosidad compleja (Fig. 5I), el módulo de almacenamiento (Fig. 5II) y el módulo de pérdida (Fig. 5III) se han ilustrado en función de la temperatura. Como se muestra en la Figura 5, todos los parámetros reológicos dependen en gran medida de la temperatura y se ha comprobado que la conversión sol-gel de ambas formulaciones se inicia cerca de los 30 °C, como se obtiene del punto de inflexión de los gráficos. Tras la formación del gel, todos los parámetros reológicos de ambas formulaciones son mucho más altos que los de la fase sol. Los valores de viscosidad compleja (I), módulo de almacenamiento (II) y módulo de pérdida (III) de PF127/TMC/PEG-HA son significativamente más altos que los de PF127 en su estado de gel, lo que indica que el hidrogel PF127 modificado con TMC y PEG-HA es mecánicamente más fuerte que los hidrogeles PF127. Los parámetros reológicos mejorados del hidrogel PF127/TMC/PEG-HA podrían ocurrir debido a las fuertes interacciones inter-micelares y TMC y PEG-HA posiblemente mejorarían la estabilidad de las micelas formadas por PF127 en el hidrogel.

Estudio de hinchamiento (sensibilidad al pH de las formulaciones de hidrogel)

El hinchamiento de las partículas de hidrogel liofilizadas bajo pH ácido (pH 5,4) utilizando tampón de acetato 0,1 M frente al tiempo (Fig. 6) a 30 °C reveló que las partículas de gel formadas por PF127/TMC/PEG-HA en el estado hinchado resistieron la disolución completa hasta 30 min y, a continuación, empezaron a disolverse en el medio para degradarse completamente justo después de 2 h. Por el contrario, PF127 en el estado hinchado resistió la degradación hasta 15 min, y se degradó completamente después de 1 h. La hidrofilia de PF127 aumentó en condiciones ácidas debido a la interacción polímero-agua, lo que dio lugar a una rápida disolución de la estructura del gel21. La sensibilidad al pH de las partículas de hidrogel liofilizadas se modificó después de añadir TMC y PEG-HA en el sistema, y la interacción inter-micelar mejorada del sistema de hidrogel modificado hizo que la resistencia a la degradación/disolución mediada por el ácido de las partículas de gel fuera mayor.

El hinchamiento de las partículas de gel bajo pH neutro (7,4) utilizando PBS 0,1 M a 30 °C reveló que las partículas de hidrogel permanecieron hinchadas durante 4 h sin ninguna evidencia de disolución. La relación de hinchamiento de PF127/TMC/PEG-HA (5,01) a pH 7,4 después de 4 h fue mayor que la de PF127 (4,23), lo que indica que la red porosa interconectada de PF127/TMC/PEG-HA acumuló más moléculas de agua en su estructura en el estado hinchado (Fig. 6).

Estudio de degradación del hidrogel bajo agitación mecánica (prueba de estabilidad mecánica)

El estudio de degradación del hidrogel de PF127/TMC/PEG-HA y PF127 bajo agitación mecánica (70 rpm) durante 14 días en condiciones de pH neural indicó que PF127/TMC/PEG-HA resistió la degradación del gel en mayor medida que el hidrogel PF127 (Fig. 7). El hidrogel de PF127/TMC/PEG-HA mostró una masa remanente del 45,4% después de la agitación mecánica durante 14 días, mientras que el sistema PF127 mostró una mayor pérdida de masa después de 14 días (masa remanente del 39,2%). Por lo tanto, la estabilidad mecánica del hidrogel aumentó tras la adición de TMC y PEG-HA a las cadenas poliméricas de PF127 en la formulación porque se formó una estructura de hidrogel más interconectada mediante esta modificación.

Estudio de MEB y TEM de las formulaciones de hidrogel

Las imágenes de MEB de PF127 cargado con ácido gálico (Fig. 8A,B) y de los hidrogeles PF127/TMC/PEG-HA (Fig. 8C,D) en estado liofilizado muestran estructuras porosas aglomeradas con tamaños de poro irregulares después de la liofilización, ya que la eliminación del agua hizo que se apilaran todas las redes interconectadas en el hidrogel. Sin embargo, la imagen de PF127/TMC/PEG-HA (recuadro azul ampliado de la Fig. 8C) en la Fig. 8D muestra una red mejor interconectada con poros más distintivos que la de PF127 solo (recuadro rojo ampliado de la Fig. 8A), ya que las interacciones inter-micelares de las cadenas de PF127 se potenciaron tras la modificación con TMC y PEG-HA55. El fármaco cargado dentro del hidrogel se distribuyó relativamente más favorablemente dentro de la estructura de gel de PF127/TMC/PEG-HA y la liberación sostenida y controlada del fármaco fue mejor en el sistema PF127 modificado debido a la estructura porosa más interconectada en la formulación original.

Las imágenes TEM de PF127 (Fig. 8E) y las formulaciones PF127/TMC/PEG-HA (Fig. 8F) en el estado sol muestran agregados micelares/micelas interconectadas que varían de 100 a 1000 nm de tamaño y que aparecen en las imágenes como gránulos de formas variadas, como se indica en los círculos punteados rojos de la Fig. 8E y los círculos punteados azules de la Fig. 8F. Como se muestra en la Fig. 8, las micelas formadas en PF127/TMC/PEG-HA (F) eran más compactas y estables que las formadas sólo con PF127 (E). Las micelas estaban formadas principalmente por cadenas de polímero PF127, y TMC y PEG-HA en la formulación PF127/TMC/PEG-HA influyeron en la formación de estructuras inter-micelares estables y compactas o agregados micelares de PF127 a través de la interacción hidrofóbica. Por lo tanto, el sistema de entrega hecho de PF127/TMC/PEG-HA hidrogel podría mostrar una buena liberación del fármaco debido a sus estructuras inter-micelares estables.

Estudio SAXS de hidrogeles

La forma liofilizada de los hidrogeles recubiertos en la placa de vidrio se colocó en paralelo al soporte de la muestra en el instrumento para la reflexión SAXS. Como se muestra en la Fig. 9, los valores de I (a. u.) de las muestras de hidrogeles se graficaron contra q (Å-1). El SAXS en modo de reflexión se realiza cuando los rayos X inciden en una muestra plana casi paralela a la superficie y da la idea de la inhomogeneidad de la red de hidrogeles56. El gráfico de I (a. u.) frente a q (Å-1) en la Fig. 9 ha mostrado la aparición de un pico en q = 0,02 Å-1 que se observa en los hidrogeles indicando la presencia de inhomogeneidad congelada y esto se debe a la presencia de una región cristalizada de alta densidad de electrones que se origina en los defectos de red inherentes a los hidrogeles57.

SAS de reflexión midiendo I (a. u.) frente a q (Å-1) de los hidrogeles cargados con el fármaco (A) PF127 y (B) PF127/TMC/PEG-HA.

Potencial zeta de las formulaciones de hidrogeles

Se midió el potencial zeta de las formulaciones en la fase sol durante 14 días para controlar la estabilidad de los componentes del sistema durante el almacenamiento. La carga superficial de los componentes en la formulación determina su estabilidad, solubilidad y aclaramiento58, y la carga superficial de un componente se mide por el potencial zeta. Tanto las formulaciones de PF127 como las de PF127/TMC/PEG-HA con el fármaco (ácido gálico) en la fase sólida mostraron valores de potencial zeta negativos (Tabla 1). PF127 en la fase sol con ácido gálico cargado mostró un potencial zeta negativo de -18,7 mV ± 6,1 a 30 °C y PF127/TMC/PEG-HA con el fármaco (ácido gálico) en la fase sol mostró un valor de potencial zeta negativo de -16,3 mV ± 5,9. Como se muestra en la Tabla 1, los valores de potencial zeta de PF127 y PF127/TMC/PEG-HA fueron -18,7 mV ± 6,5 y -14,6 mV ± 7,7, respectivamente, después de 14 días de almacenamiento a 30 °C. Por lo tanto, todos los componentes de las formulaciones se distribuyeron uniformemente en el sistema sin precipitación, ya que no se encontró ningún cambio significativo en los valores de potencial zeta para ambas formulaciones durante el período de almacenamiento. Además, las cargas superficiales de las micelas no se modifican significativamente en la formulación PF127/TMC/PEG-HA, ya que TMC y PEG-HA tienen cargas opuestas y, por lo tanto, el potencial zeta resultante de PF127/TMC/PEG-HA es similar al potencial zeta de la formulación con PF127 solamente.

Estudio FTIR de los hidrogeles cargados con fármacos

La figura 10 muestra los picos FTIR característicos del hidrogel PF127/TMC/PEG-HA cargado con ácido gálico en la forma liofilizada (cm-1), y estos picos son 3445 (estiramiento O-H, PF127, TMC, PEG-HA y ácido gálico); 2891 (estiramiento C-H), PF127, TMC, PEG-HA y ácido gálico; 1644 (estiramiento C=O), TMC y PEG-HA; 1282 (estiramiento C-O-C), PF127, TMC y PEG-HA; 1110 (estiramiento simétrico C-C-O) PF127; 964 (estiramiento asimétrico C-C-O), PF127. Se observaron picos característicos similares en el análisis FTIR del hidrogel PF127 cargado con ácido gálico. Los picos FTIR del hidrogel PF127 cargado con ácido gálico en la forma liofilizada son 3445 cm-1 (estiramiento O-H), PF127 y ácido gálico; 2891 cm-1 (estiramiento C-H), PF127 y ácido gálico; 1282 cm-1 (estiramiento C-O-C), PF127; 1110 (estiramiento simétrico C-C-O) PF127; y 964 (estiramiento asimétrico C-C-O), PF127. El pico amplio encontrado en 3445 cm-1 de ambas formulaciones de hidrogeles sugirió que el ácido gálico se cargó efectivamente en los hidrogeles.

Espectro FTIR de los hidrogeles PF127 y PF127/TMC/PEG-HA cargados con el fármaco con doble respuesta (pH/temperatura).

Estudio de liberación acumulativa

El estudio de liberación se realizó para examinar la liberación de ácido gálico de los hidrogeles PF127/TMC/PEG-HA y PF127 en PBS 0,1 M (pH 7,4) y a 37 °C (Fig. 11). Ambas formulaciones mostraron una liberación de ráfaga del fármaco (ácido gálico) en una etapa inicial (dentro de las 5 h) con un 64,60% ± 1,112 y un 50,31% ± 0,411 de liberación del fármaco para los hidrogeles PF127/TMC/PEG-HA y PF127, respectivamente. Después de 5 días, se produjo una liberación acumulada del fármaco del 87,61% ± 1,112 y del 75,20% ± 0.850 para los hidrogeles PF127/TMC/PEG-HA y PF127, respectivamente, lo que indica que el sistema de hidrogeles modificado hecho de PF127 con TMC y PEG-HA funcionó mejor como sistema de liberación de fármacos. Los cambios morfológicos de PF127/TMC/PEG-HA, como la mejora de las interacciones inter-micelares y una estructura de red porosa bien formada, mejoraron la liberación del fármaco en condiciones de pH neutro.

Liberación acumulativa (%) de fármaco (ácido gálico) de (A) PF127 y (B) hidrogeles PF127/TMC/PEG-HA a pH 7,4 y 37 °C durante 5 días en tampón PBS 0,1 (M). Los datos representan la media de los experimentos de liberación por triplicado ± SD y el ajuste de los datos de liberación del fármaco a tres modelos de tasa diferentes de orden cero, de primer orden y de Higuchi.

Figura 11 Los valores de liberación acumulada del fármaco (ácido gálico) de los hidrogeles se ajustan con diferentes modelos de tasa cinética (Fig. 11), y las constantes de tasa de los diferentes modelos de tasa para todas las variedades de hidrogel se tabulan en la Tabla 2. El ajuste de los datos de liberación a varios modelos de tasa se expresan en valores R2 (Fig. 11).

El modelo de tasa de orden cero viene dado por la ecuación:

donde Qt es la cantidad acumulada de liberación de fármaco del hidrogel en el tiempo t (h), Qo es la cantidad inicial de fármaco cargado en el hidrogel, y k0 es la constante de velocidad de orden cero (seg-1). La tasa de liberación del fármaco mediante la ecuación de tasa de orden cero es independiente de la cantidad inicial de fármaco cargada en el hidrogel.

El modelo de tasa de primer orden viene dado por la siguiente forma no lineal:

donde Qt es la cantidad acumulada de liberación de fármaco del hidrogel en el tiempo t (h), Qo es la cantidad inicial de fármaco cargado en el hidrogel, y k1 es la constante de velocidad de primer orden (seg-1). La tasa de liberación del fármaco por la ecuación de tasa de primer orden depende de su concentración (la cantidad inicial de fármaco cargado en el hidrogel).

La ecuación de tasa de Higuchi sugiere la liberación del fármaco de los hidrogeles por el método de difusión y la forma no lineal de la ecuación de tasa de Higuchi es:

donde Qt es la cantidad acumulada de liberación de fármaco del hidrogel en el tiempo t (h), y kH es la constante de Higuchi (seg-0.5).

El ajuste de los datos de liberación a los diferentes modelos de tasa (Fig. 11) indica que la tasa de liberación del fármaco de las formulaciones de hidrogeles sigue de cerca la ecuación de tasa de primer orden, ya que tanto los hidrogeles PF127 cargados con ácido gálico como los PF127/TMC/PEG-HA muestran valores R2 de 0,990, que son superiores a los obtenidos con otros modelos de tasa utilizados en este estudio. Por lo tanto, la tasa de liberación del fármaco de los hidrogeles depende de la concentración inicial del fármaco cargado en los hidrogeles. Como se observa en la Tabla 2, k1 (seg-1) es menor que otras constantes de velocidad para ambas variedades de hidrogeles, por lo que la liberación sostenida del fármaco desde el hidrogel sigue más estrechamente el modelo de velocidad de primer orden que cualquier otro modelo de velocidad utilizado aquí.