El objetivo general de este ensayo de inhibición de la hemaglutinación es medir los títulos de anticuerpos contra virus específicos de interés. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la vacunación sobre la inmunidad mediada por la vacuna y la protección dentro de diferentes poblaciones y a través de varios grupos de edad y de pacientes. Las principales ventajas de esta técnica son que es precisa y que permite la determinación rápida del título de la presencia de anticuerpos neutralizantes.
Aunque este método puede proporcionar una visión de los títulos de anticuerpos humanos, también puede aplicarse a otros sistemas, como los títulos de anticuerpos para el suero de ratón, también sobrenadantes de cultivo. Comience etiquetando las placas de microtitulación de 96 pocillos con la información experimental apropiada. A continuación, gire la placa en la orientación vertical y utilice una pipeta multicanal para añadir 25 microlitros de PBS a cada pozo, excepto al primer pozo de la fila inferior de valoración posterior.
Añada 50 microlitros de la solución de antígeno de interés recién preparada al primer pozo de la fila de valoración posterior, seguido de la adición de 25 microlitros de muestras de suero tratadas con RDE a los primeros pozos de las diez filas superiores. Añadir 25 microlitros del antisuero apropiado al primer pocillo de la undécima fila como control positivo. Transfiera 25 microlitros del primer pozo de cada fila a sus pozos sucesivos para realizar diluciones seriadas dobles.
Pipetee hacia arriba y hacia abajo de 10 a 15 veces para cada paso de dilución, desechando los 25 microlitros finales de los últimos pozos. A continuación, añada 25 microlitros de la solución de antígeno a cada pocillo de las filas 1 a 11 y 25 microlitros de PBS sólo a cada pocillo de la fila de valoración posterior. Golpee la placa cuidadosamente 10 veces por los cuatro lados para mezclar.
A continuación, cubra la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, añadir 50 microlitros de solución de glóbulos rojos a cada pocillo y mezclar la placa con más golpecitos. A continuación, cubra de nuevo la placa e incube los glóbulos rojos según la especie utilizada, tal como se indica en la tabla.
Después de añadir los glóbulos rojos a la placa, respete el tiempo de incubación adecuado para el tipo de sangre utilizado en el ensayo. Una incubación demasiado corta o demasiado larga conducirá a una interpretación incorrecta de los resultados. Al final de la incubación, evalúe la hemaglutinación inclinando la placa 90 grados durante 25 segundos y marque los resultados de cada pocillo, mientras la placa sigue inclinada, en un esquema impreso de la placa de 96 pocillos.
En este experimento, se evaluó la respuesta de anticuerpos inducida por la vacuna en 26 voluntarios sanos que recibieron una vacuna antigripal inactivada y trivalente que contenía gripe A/H1N1/California/2009, A/H3N2/Texas/2012 y B/Massachusetts/O2/2012 antes de la temporada de gripe de 24 2015. Se observó una respuesta inmunitaria cruzada para las cepas de virus A/H3N2/Suiza/2013 y A/H3N2/Texas/2012, con títulos de inhibición de la hemaglutinación de media geométrica significativamente menores y seroprotección inducida contra la gripe A/H3N2/Suiza/2013 en comparación con la gripe A/H3N2/Texas/2012. Tras la vacunación, los títulos de anticuerpos contra ambas cepas aumentaron, a pesar de que la cepa A/H3N2/Suiza/2013 no estaba presente en la vacuna.
La hemaglutinina viral demuestra un potencial dependiente de la especie para la hemaglutinación de eritrocitos. Es interesante que la sangre de cobaya no se hemaglutine adecuadamente con la gripe B y que la sangre de pavo tenga el potencial de hemaglutinación con títulos altos y una baja reactividad cruzada. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en las tres horas si se realiza correctamente.
Mientras se intenta este procedimiento es importante recordar que hay que poner suero con RDE para inactivar cualquier inhibidor inespecífico y unión inespecífica durante la hemaglutinación del virus. Tras este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el ELISA para responder a preguntas adicionales sobre el papel de las inmunoglobulinas específicas de cada patógeno. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores del campo de la inmunología vírica profundizaran en nuestra comprensión de la inmunidad relacionada con la vacuna en pacientes sanos e inmunodeprimidos dentro de diferentes grupos de edad.
Después de ver este vídeo, debería comprender bien cómo realizar un ensayo de inhibición de la hemaglutinación para cuantificar los títulos de anticuerpos específicos de la cepa de la gripe a gran escala. No olvide que trabajar con antígenos virales, sangre de animales y muestras de suero humano puede ser extremadamente peligroso y que siempre deben tomarse precauciones como trabajar en un laboratorio BSL2 mientras se realiza este procedimiento.