El biofísico Adam Cohen paseaba por San Francisco, California, en 2010, cuando una llamada telefónica le sorprendió. «Tenemos una señal», dijo el interlocutor. A casi 5.000 kilómetros de distancia, en Cambridge (Massachusetts), sus colaboradores habían encontrado oro. Tras meses de experimentos fallidos, los investigadores habían encontrado una proteína fluorescente que les permitía observar las señales que pasaban entre las neuronas.
Pero había algo raro. Cuando Cohen regresó a su laboratorio en la Universidad de Harvard, se enteró de que todas las grabaciones del experimento mostraban una extraña progresión. Al principio, las neuronas decoradas con la proteína parpadeaban muy bien cuando los impulsos eléctricos las atravesaban. Pero luego las células se convirtieron en manchas brillantes. «A mitad de cada grabación, la señal se volvía loca», dice Cohen.
Así que decidió unirse a su equipo durante un experimento. «Cuando empezaban la grabación, se sentaban conteniendo la respiración», dice Cohen. Pero en cuanto se daban cuenta de que funcionaba, lo celebraban, «bailando y corriendo por la habitación».
En su exuberancia, dejaban que la luz de una lámpara de escritorio diera justo en el microscopio. «En realidad, estábamos grabando nuestra excitación», dice Daniel Hochbaum, entonces estudiante de posgrado en el grupo de Cohen. El equipo redujo el tono de sus celebraciones y, un año después, publicó su estudio1, uno de los primeros en demostrar que una proteína fluorescente diseñada en neuronas específicas de mamíferos podía utilizarse para rastrear impulsos eléctricos individuales en tiempo real.
Los neurocientíficos llevan décadas intentando observar las rápidas señales eléctricas que son un componente importante del lenguaje del cerebro. Aunque los electrodos, el caballo de batalla para medir el voltaje, pueden registrar con fiabilidad la actividad de neuronas individuales, tienen dificultades para captar las señales de muchas, sobre todo durante períodos prolongados. Pero en las dos últimas décadas, los científicos han encontrado una forma de incrustar proteínas fluorescentes indicadoras de voltaje directamente en las membranas celulares de las neuronas. Con el tipo de microscopio adecuado, pueden ver cómo las células se iluminan mientras hablan entre sí, ya sea en un susurro o en un grito. Las imágenes de voltaje también pueden registrar el parloteo eléctrico entre muchas neuronas a la vez, y luego promediar esas señales a través de grandes trozos de tejido cerebral. Esto ayuda a los investigadores a estudiar la actividad eléctrica del cerebro en diferentes escalas espaciales, escuchando no sólo las voces de las células individuales, sino también «el rugido de la multitud», dice Cohen.
En los últimos 5 años, los científicos han publicado unos 1.000 artículos sobre el tema, y los principales planes de financiación, como la iniciativa BRAIN de los Institutos Nacionales de Salud de EE.UU., han acelerado el desarrollo de nuevos tipos de indicadores de tensión modificados genéticamente. Con la esperanza de encontrar mejores variantes, algunos grupos han ideado estrategias para examinar millones de proteínas en busca de características deseadas, como el brillo. Uno de estos enfoques ha identificado un indicador que es dos veces más brillante que los sensores similares desarrollados apenas cuatro años antes2.
A medida que estas proteínas mejoran, y los avances en microscopía facilitan su visualización, los científicos esperan iluminar el mayor rompecabezas de la neurociencia: cómo las células del cerebro trabajan juntas para transformar un sistema de pulsos eléctricos en pensamientos, acciones y emociones. Los investigadores siguen luchando por captar toda la actividad y por idear formas de ver los nervios que se disparan rápidamente y en lo más profundo del tejido cerebral. Pero si los avances consiguen resolver estos retos técnicos, «sería revolucionario», dice Rafael Yuste, que estudia el funcionamiento de los circuitos neuronales en la Universidad de Columbia, en Nueva York.
Proceso de alta velocidad
El cerebro humano medio contiene unos 120.000 millones de neuronas, que reciben y envían constantemente información a través de unos apéndices en forma de rama llamados dendritas. Las señales químicas o eléctricas que llegan a las dendritas producen pequeños cambios de voltaje a través de la membrana de la célula, que se dirigen al cuerpo celular. Cuando la suma de los cambios de voltaje alcanza un punto de no retorno, llamado umbral, la neurona dispara un gran pico eléctrico, un potencial de acción. Esta sacudida se dispara a velocidades de hasta 150 metros por segundo a lo largo de una rama neuronal, conocida como axón, hasta otro conjunto de apéndices ramificados. Aquí, las señales químicas o eléctricas transmiten la información al siguiente conjunto de dendritas.
Las señales neuronales convergen, divergen y se sincronizan para producir una sinfonía de pensamientos, emociones, acciones y reacciones, desde el rubor de una cara hasta el hipo de un bebé. Pero las herramientas de escucha de los científicos son muy limitadas. Desarrollados por primera vez en la década de 1940, los electrodos en miniatura, tan finos como un cabello, pueden insertarse en el cerebro, contra o dentro de las neuronas, donde miden el voltaje de la membrana con precisión y rapidez. Pero este método sólo puede utilizarse para controlar una o un puñado de neuronas a la vez, y sólo durante un tiempo limitado, porque los electrodos acaban dañando la célula. Es como intentar captar la esencia de un arreglo orquestal siguiendo a un solo intérprete durante unos segundos.
Los haces de microelectrodos pueden registrar la actividad eléctrica de hasta 200 células a la vez, pero como estos electrodos se colocan cerca de las neuronas y no dentro de ellas, sólo pueden detectar los potenciales de acción, los picos más agudos de la actividad eléctrica. Son sordos a las notas más suaves: los pequeños cambios eléctricos que no llevan a la neurona hasta un potencial de acción. Estos cambios de voltaje por debajo del umbral son clave para la función cerebral, ya que se suman gradualmente para determinar si una neurona se dispara o no.
Con la esperanza de medir una actividad cerebral más tranquila en poblaciones más grandes de células, los científicos comenzaron a jugar en la década de 1960 con la idea de un sensor o sonda que se hace fluorescente en respuesta a una señal eléctrica. Las sondas más populares, llamadas indicadores de calcio, se iluminan cuando se unen al calcio, que fluye hacia la neurona como resultado de un pico de actividad eléctrica. Pero la técnica, conocida como imagen de calcio, sólo proporciona una aproximación; no registra directamente el voltaje de la membrana. Y aunque muestra la señal de grandes eventos, como los potenciales de acción, pasa por alto cosas que son cruciales para la función cerebral, como las sutiles oscilaciones del voltaje de la membrana o las señales eléctricas que inhiben los potenciales de acción. Imagínese que sólo puede escuchar una ráfaga de aplausos después de un concierto sinfónico: está claro que la orquesta ha actuado, pero lo que estaba tocando es una incógnita.
En la década de 1970, los científicos empezaron a desarrollar sensores de colorante que detectan directamente los cambios en el voltaje de la membrana. Las primeras versiones de estos colorantes tenían que pintarse sobre el cerebro de forma indiscriminada, por lo que etiquetaban todos los tipos de células, incluidas las no neuronales, lo que dificultaba el análisis de la actividad de neuronas específicas.
Entonces, en la década de 1990, los investigadores empezaron a probar indicadores que podían ser modificados genéticamente para que aparecieran sólo en las neuronas de interés. El primer3 indicador de voltaje codificado genéticamente (GEVI) se desarrolló en 1997; desde entonces, los científicos han producido más de dos docenas de sensores4. Algunos de ellos se fabrican combinando una proteína sensible al voltaje con moléculas fluorescentes (véase «Los sabores de la fluorescencia»). Cuando estas proteínas detectan un cambio de voltaje, cambian su estructura 3D y alteran la fluorescencia de la molécula a la que están acopladas. Otros indicadores de voltaje son versiones mutadas de rodopsinas microbianas, moléculas fluorescentes que provocan un cambio de voltaje a través de la membrana plasmática en respuesta a la luz. Estas proteínas también pueden funcionar a la inversa, cambiando su respuesta a la luz -y por tanto su fluorescencia- en respuesta a un cambio en el voltaje de la membrana.
Todo en el detalle
Hasta ahora, los GEVI han demostrado ser exitosos en el seguimiento de potenciales de acción individuales tanto en neuronas cultivadas, crecidas en un plato, como en los cerebros intactos de una amplia gama de animales, desde insectos5 hasta ratones6. Una de las mayores promesas de la técnica es su potencial para registrar no sólo los grandes eventos, sino también los pequeños cambios subumbrales en el voltaje de la membrana que reflejan los mensajes que una neurona recibe de las células vecinas, afirma Cohen. «Las imágenes de voltaje permiten ver las entradas a las neuronas in vivo, algo que antes no podíamos ver», afirma.
El año pasado, Cohen y sus colegas desarrollaron nuevos GEVI y mejoraron las técnicas de microscopía para registrar esos cambios de voltaje subumbrales de muchas neuronas a la vez, incluso en el cerebro del ratón7,8. El equipo también pudo registrar la actividad eléctrica de las mismas neuronas hasta una semana después. La capacidad de saber exactamente qué neuronas se están registrando y de seguirlas a lo largo del tiempo permite a los investigadores observar el cableado entre esas neuronas, afirma Ed Boyden, neurocientífico del Instituto Tecnológico de Massachusetts en Cambridge. De este modo, «se puede relacionar la estructura del cerebro con su función», afirma. «Ésa es una de las cuestiones centrales de toda la neurociencia».
Otra ventaja de los GEVI es que, a diferencia de los electrodos, que registran principalmente las señales del cuerpo celular, pueden registrar las señales eléctricas de cualquier parte de una célula nerviosa, hasta las puntas de las dendritas (véase «Golpear la balanza»). Es como poder escuchar específicamente las notas que toca la mano izquierda de un pianista. «Es algo con lo que llevo soñando mucho tiempo, y no soy la única», afirma Katalin Toth, neurobióloga de la Universidad Laval de Quebec (Canadá). Muchos neurocientíficos se esfuerzan por seguir el voltaje a través de neuronas enteras para ver cómo cambia en diferentes regiones de la célula, dice.
Wei Wei, neurobióloga de la Universidad de Chicago (Illinois), está utilizando los GEVI para averiguar cómo se integran las diferentes entradas eléctricas en las neuronas de la retina del ratón. Wei está interesado en un tipo de neuronas que responden con mayor intensidad a un estímulo visual cuando se mueven en una dirección determinada. Al observar cómo cambia el voltaje de la membrana en diferentes partes de estas neuronas, espera entender cómo las células suman las señales entrantes para detectar la dirección del movimiento.
El neurofisiólogo Vincent Villette, de la Escuela Normal Superior de París, planea utilizar sensores de voltaje para estudiar cómo las fluctuaciones regulares de las señales eléctricas subumbrales determinan cómo las neuronas del cerebelo del ratón coordinan la actividad muscular. «Hay mucho que entender sobre cómo las células actúan juntas», dice Villette.
Obtener una lectura visual del voltaje de la membrana también permite a los científicos ver las señales eléctricas que inhiben el disparo neuronal en lugar de desencadenarlo. Debido a que las señales inhibitorias son imposibles de registrar con enfoques como las imágenes de calcio, no está claro cómo exactamente dan forma a la actividad cerebral, dice Rosa Cossart, neurobióloga del Instituto Mediterráneo de Neurobiología en Marsella, Francia.
Cossart lleva años utilizando electrodos e imágenes de calcio, pero ahora está deseando probar los GEVI. Espera que estos sensores le permitan medir el voltaje a alta velocidad en múltiples neuronas -al menos 50- al mismo tiempo en un ratón vivo. Esto ayudaría a entender cómo los grupos de neuronas integran las señales eléctricas -tanto excitatorias como inhibitorias- para apoyar actividades que son cruciales para el desarrollo y la función del cerebro, dice.
Desafíos profundos
A pesar de las grandes expectativas, conseguir que los GEVIs funcionen en el laboratorio puede ser una molestia. Por ejemplo, Helen Yang, estudiante de posgrado en la Universidad de Stanford (California), decidió probar los GEVI para estudiar las neuronas del sistema visual de la mosca de la fruta. Pero al mirar por el microscopio durante su primer experimento, Yang no observó ningún cambio en la fluorescencia de las células, ni siquiera al dirigir una luz brillante a los ojos de las moscas. No fue hasta que analizó los datos cuando se dio cuenta de que los estímulos visuales producían una señal, pero muy pequeña. «Yo estaba muy emocionada, pero mis compañeros de laboratorio no tanto», dice. «Las respuestas eran bastante pequeñas y ruidosas»
Yang empezó a jugar con los ajustes del microscopio, aumentando la potencia del láser y acelerando la obtención de imágenes. «Básicamente lo hice ir tan rápido como nuestro microscopio podía», dice. Esto se debe a que la respuesta del indicador a una señal eléctrica era tan rápida que el cambio de fluorescencia era detectable sólo durante una fracción de segundo. «Si sólo se captura un fotograma durante el tiempo en que la célula responde, la respuesta no parece grande en absoluto», afirma Yang.
Yang consiguió finalmente utilizar los GEVI para investigar cómo las neuronas de las moscas procesan las señales visuales5, pero el tipo de retos a los que se enfrentó han impedido hasta ahora que la obtención de imágenes de voltaje se convierta en una técnica habitual. Requiere plataformas de microscopio avanzadas, a menudo construidas a medida, dice Cohen. «No se puede hacer esto en el microscopio fluorescente de tu abuela».
En los últimos cinco años, el apoyo financiero de la iniciativa BRAIN ha impulsado los avances en este campo, incluido el desarrollo de mejores GEVI, dice Michael Lin, ingeniero de proteínas de Stanford.
Paralelamente al desarrollo de nuevos sensores, los científicos trabajan en técnicas para obtener imágenes precisas de las rápidas señales eléctricas que recorren el cerebro. Uno de los retos es que la mayoría de las técnicas disponibles sólo funcionan bien con células en una placa o en la superficie del cerebro. Pero el cerebro de los mamíferos no es transparente: de hecho, parece tofu, dice Na Ji, físico de la Universidad de California en Berkeley.
Para profundizar en él, los investigadores tienen que recurrir a métodos más invasivos, como extirpar parte del tejido subyacente o introducir directamente en el cerebro unos diminutos dispositivos ópticos llamados microendoscopios. Una forma alternativa y no invasiva de observar los tejidos opacos -hasta un milímetro de profundidad- es la microscopía de dos fotones. Esta técnica utiliza luz de mayor longitud de onda y menor energía, que puede penetrar más profundamente en los tejidos. Dado que los microscopios de dos fotones iluminan y registran desde un solo punto a la vez, capturan imágenes con demasiada lentitud para rastrear gran parte del rápido parloteo del cerebro. Pero los especialistas confían en que los avances en la tecnología permitirán pronto ver las señales producidas por los GEVI a mayor velocidad. «Es absolutamente factible», afirma Ji.
Si los diferentes enfoques pueden superar estos retos, los científicos no dudan de que las imágenes de voltaje se convertirán en un enfoque estándar para medir la actividad cerebral. «En los próximos uno o dos años, veremos muchos trabajos que han aplicado sensores de voltaje y han aprendido sobre biología», dice Thomas Clandinin, neurobiólogo de Stanford. Algunos dicen que la técnica podría incluso sustituir a los electrodos para cuestiones relacionadas con el modo en que las neuronas procesan e integran la información.
Los investigadores que inician su carrera son especialmente optimistas: Hochbaum, que ahora es becario postdoctoral en la Facultad de Medicina de Harvard, en Boston, dice que, a largo plazo, los GEVI serán una herramienta imprescindible para estudiar cómo responden los distintos compartimentos de la célula a las señales subumbrales. Tiene previsto utilizar las imágenes de voltaje para entender cómo esas señales alteran la conexión entre neuronas, un proceso clave en el aprendizaje. Las posibilidades son apasionantes, dice Hochbaum, pero ha aprendido al menos una lección importante de aquellos primeros días en los que saltaba de alegría por el laboratorio tras ver un resplandor en el microscopio: cuando los experimentos funcionan, hay que mantener las celebraciones al mínimo.