Pentru a demonstra utilizarea Escher-FBA pentru aplicații reale, prezentăm patru exemple cheie de FBA care pot fi executate direct în browser. Acestea sunt adaptate dintr-o analiză a FBA și a aplicațiilor sale . Aceste exemple se bazează pe modelul de bază implicit al E. coli, astfel încât acestea sunt gata să fie implementate imediat ce este deschisă pagina web Escher-FBA. Asigurați-vă că faceți clic pe butonul Reset Map (Resetare hartă) între fiecare exemplu. Dacă întâmpinați dificultăți în găsirea unei reacții, dați pur și simplu clic pe opțiunea Find din meniul View (sau pe tasta „f” de pe tastatură) pentru a deschide o bară de căutare.
FBA cu substraturi alternative de carbon
Primul exemplu demonstrează utilizarea FBA pentru a prezice dacă poate avea loc creșterea pe substraturi alternative de carbon. Modelul de bază implicit al E. coli include un mediu minimal simulat cu D-glucoză ca sursă de carbon. Aici, vom schimba sursa de carbon din D-glucoză în succinat. Mai întâi, treceți cu mouse-ul peste reacția de schimb de succinat EX_succ_e și modificați limita inferioară la – 10 mmol/gDW/h., fie trăgând cursorul, fie introducând – 10 în câmpul Lower Bound. Apoi, treceți cu mouse-ul peste reacția de schimb de D-glucoză EX_glc_e și fie ridicați limita inferioară la 0, fie faceți clic pe butonul Knockout. Obiectivul implicit este în continuare de a maximiza creșterea, astfel încât aceste două modificări vor instrui programul să calculeze rata maximă de creștere în timp ce utilizează succinat ca sursă de carbon în loc de D-glucoză. Ar trebui să vedeți că rata maximă de creștere preconizată scade de la 0,874 h- 1 la 0,398 h- 1, reflectând randamentul de creștere mai mic al E. coli cu succinat (Fig. 2a). Aceasta este abordarea generală pentru a face modificări în Escher-FBA; treceți cu mouse-ul peste reacție, faceți modificările necesare, iar Escher-FBA va afișa automat rezultatele dumneavoastră. Valorile limitei inferioare pentru schimbul de surse de carbon reprezintă măsurători experimentale, astfel încât puteți încerca să ajustați valoarea specifică a limitei inferioare la valori realiste pentru creșterea pe alte surse de carbon.
Exemple de simulări Escher-FBA. (a) Creștere simulată cu succinat ca unică sursă de carbon. (b) Creștere anaerobă simulată pe un mediu minim de glucoză. (c) Maximizarea randamentului ATP în modelul implicit. (d) Creșterea modelului iMM904 de S. cerevisiae. Rețineți că lățimea săgeților a fost mărită în meniul de setări pentru a face schimbările mai evidente
FBA în timpul creșterii anaerobe
Creșterea anaerobă poate fi simulată în același mod, trecând cu mouse-ul peste reacția EX_o2_e și făcând clic pe Knockout sau modificând limita inferioară la 0. Dacă modificați schimbul de oxigen la zero în timp ce succinatul este încă singura sursă de carbon, indicatorul Flux Through Objective afișează „Infeasible solution/Dead cell”, ceea ce înseamnă că nu este posibilă creșterea. Încercați să faceți clic pe butonul Reset din colțul din dreapta jos pentru a simula un mediu minimal cu D-glucoză ca sursă de carbon, apoi eliminați EX_o2_e, iar rata de creștere prognozată ar trebui să fie de 0,211 h- 1 (Fig. 2b).
FBA cu obiective compuse
Escher-FBA suportă setarea de obiective multiple în modul Compound Objectives. În modelul implicit, setarea unui nou obiectiv dezactivează întotdeauna obiectivul anterior. Pentru a activa acest mod, faceți mai întâi clic pe butonul Compound Objectives (Obiective compuse) din partea de jos a ecranului. Ca exemplu de utilizare a modului: pentru a verifica rata maximă de creștere, minimizând în același timp fluxul prin SUCDi, începeți cu obiectivul implicit de maximizare a producției de biomasă. Apoi, treceți cu mouse-ul peste eticheta reacției pentru SUCDi și faceți clic pe butonul Minimize (Minimizare) din cadrul tooltip-ului. În partea dreaptă jos, ar trebui să vedeți ambele obiective enumerate. Rețineți că numai coeficienții obiectivului de 1 sau – 1 (reprezentați de Maximize și Minimize) sunt suportați în prezent. Pentru a reveni la obiective unice, trebuie doar să faceți din nou clic pe butonul Compound Objectives.
Analiza randamentelor metabolice
De asemenea, putem utiliza Escher-FBA pentru a determina randamentele maxime ale precursorilor și cofactorilor, cum ar fi ATP. Tot ceea ce este necesar este o reacție echilibrată stoichiometric care consumă cofactorul de interes. Reacția de menținere a ATP (ATPM) este un astfel de exemplu. Pentru a determina producția maximă de ATP, pur și simplu treceți cu mouse-ul peste reacția ATPM și faceți clic pe butonul Maximize. Configurarea obiectivului în acest mod funcționează deoarece, pentru ca sistemul să maximizeze fluxul prin reacția ATPM, trebuie mai întâi să producă ATP în cea mai mare cantitate posibilă. Atunci când ATPM este maximizat în modelul implicit de metabolism de bază al E. coli, valoarea obiectivului este de 175 mmol/gDW/h. (Fig. 2c). Cu succinat ca sursă de carbon, această valoare scade la 82,5 mmol/gDW/hr. Aceeași procedură poate fi urmată pentru orice metabolit de interes prin crearea unei reacții de consum echilibrate stoichiometric și setarea modelului pentru a maximiza fluxul prin această reacție. Rețineți că în prezent nu este posibilă crearea automată a unei astfel de reacții în Escher-FBA, dar acest lucru poate fi adăugat într-o versiune viitoare.
Analiza variabilității fluxului
Analiza soluțiilor optime alternative în metabolism este o altă aplicație utilă a FBA . Deoarece soluțiile produse prin FBA sunt adesea neunice, poate fi util să se cunoască intervalul de valori ale fluxului pe care o anumită reacție îl poate avea. Analiza variabilității fluxului (FVA) este adesea utilizată pentru a calcula aceste intervale pe întreaga rețea . Escher-FBA nu suportă calculele FVA în mod direct, dar este posibil să le calculați pentru o anumită reacție. Pentru a face acest lucru, treceți mai întâi cu mouse-ul peste funcția obiectiv (reacția de biomasă Biomass_Ecoli_core_w_GAM) și setați limitele superioare și inferioare la o valoare ușor mai mică decât valoarea fluxului curent (în harta implicită, încercați 0,870). În continuare, treceți cu mouse-ul peste o reacție de interes și faceți clic pe butoanele Maximize (Maximizare) și Minimize (Minimizare) pentru a vedea fluxul maxim și minim prin reacția respectivă, având în vedere rata de creștere optimă. De exemplu, maximizarea și minimizarea fluxului prin GAPD în glicoliză produce un interval de flux fezabil de 15,44-16,68 mmol/gDW/h., ceea ce indică faptul că fluxul glicolitic este foarte constrâns la rate de creștere ridicate. Pe de altă parte, maximizarea și minimizarea fluxului prin MALS în derivația de glioxilat produce un interval de flux fezabil de 0-2,64 mmol/gDW/h., ceea ce indică faptul că derivația de glioxilat poate fi activată sau inactivă la rate de creștere ridicate. Această procedură se poate face cu orice set de reacții, iar utilizatorul își poate constrânge sistemul la orice număr de valori ale fluxului pentru a vedea gama de soluții disponibile pentru o anumită reacție.
Utilizarea altor modele la scară genomică
Modelul de bază implicit al E. coli nu este singurul sistem care poate fi simulat. De exemplu, dacă se dorește să se efectueze simulări pe o celulă de drojdie, un model și o hartă pentru Saccharomyces cerevisiae pot fi descărcate de la http://bigg.ucsd.edu/models/iMM904. Pe pagina respectivă, faceți clic pe butonul de descărcare a modelului (iMM904.json) și a hărții (iMM904.Central carbon metabolism.json). Încărcați-le în Escher-FBA făcând clic pe Load Map JSON în meniul Map și Load Model JSON în meniul Model pentru a încărca ambele fișiere JSON. Odată încărcată, harta este pregătită pentru a fi editată și simulată cu oricare dintre instrumentele din Escher sau Escher-FBA (Fig. 2d). Cu un model mai mare, cum ar fi iMM904, nu toate reacțiile vor fi vizibile deodată, dar puteți adăuga o reacție la vizualizare. Mai întâi, fie faceți clic pe pictograma cu cheie din bara laterală, fie selectați Add reaction mode (Adăugare mod de reacție) din meniul Edit (Editare). Acum, reacțiile pot fi adăugate făcând clic oriunde pe hartă și selectând reacția dorită din meniul derulant. Câmpul de introducere a textului poate fi utilizat pentru a căuta o reacție de interes.
Aplicarea Escher-FBA la proiectarea fabricii de celule microbiene
Pentru a oferi un exemplu de ipoteză de cercetare care poate fi testată cu ajutorul Escher-FBA, am încărcat modele la scară genomică de E. coli care conțin două căi de producere a 1-propanolului pentru producția chimică. Aceste căi au fost analizate recent într-un studiu privind puterea de predicție a modelelor la scară genomică pentru simularea tulpinilor reale de fabrici de celule microbiene . Primul model include o singură cale de producere a 1-propanolului (Fișier suplimentar 1), raportată pentru prima dată de Atsumi et al. . Al doilea model include două căi sinergice pentru producerea de 1-propanol (Fișier suplimentar 2), raportate pentru prima dată de Shen și Liao . Fiecare model poate fi încărcat separat (cu butonul de meniu Model > Load COBRA model JSON) și este furnizată o singură hartă a metabolismului central care este compatibilă cu ambele modele (Fișierul suplimentar 3, poate fi încărcat cu Map > Load Map JSON).
Am fost curioși dacă abordarea sinergică pentru producția de 1-propanol – despre care se știe că are un randament de producție mai mare – are, de asemenea, o diferență în utilizarea căilor necesare. Prin urmare, am încărcat fiecare model individual, am maximizat excreția de 1-propanol (am trecut peste EX_1poh_e și am făcut clic pe Maximize), am stabilit limita inferioară pentru excreție la 99% din maxim, apoi am minimizat fluxul prin prima etapă angajată a căii pentozei fosfat, glucoza 6-fosfat dehidrogenază (G6PDH2r). Hărțile rezultate demonstrează că că căile sinergice pentru producerea de 1-propanol sunt echilibrate stoichiometric cu glicoliza, deci nu necesită activitatea PPP (Fig. 3b). Pe de altă parte, calea individuală necesită un flux PPP semnificativ (Fig. 3a). Alte utilizări ale căilor, cum ar fi fluxul TCA necesar pentru fiecare caz în parte, pot fi, de asemenea, explorate pe aceste hărți.
Utilizarea căilor pentru două căi heterologe de producere a 1-propanolului în E. coli. Fluxul căii pentozei fosfat (PPP) necesar pentru fiecare cale de producție heterologă poate fi comparat, în primul rând, forțând producția de 1-propanol să fie de 99% din valoarea maximă (prin stabilirea limitei inferioare a reacției de schimb de 1-propanol) și, în al doilea rând, minimizând fluxul prin prima etapă a PPP. (a) Calea 1-propanolului raportată de Atsumi et al. utilizează o singură cale pentru a obține producția de 1-propanol. Aceasta necesită un flux PPP semnificativ și are un randament global mai scăzut. (b) Calea raportată de Shen și Liao utilizează în mod sinergic două căi pentru a obține un randament mai mare. Calea este echilibrată stoichiometric cu glicoliza, astfel încât nu necesită flux PPP
În timp ce Escher-FBA poate fi deja utilizat pentru multe simulări FBA direct în browserul web, o serie de exemple prezentate de Orth et al. nu pot fi realizate în prezent cu Escher-FBA . Deocamdată, Escher-FBA nu poate efectua funcții cum ar fi analiza knock-out-ului de gene sau analiza robusteții. Cu toate acestea, Escher-FBA utilizează reprezentări SVG flexibile pentru elementele vizuale, astfel încât ar putea fi adăugate analize de robustețe și chiar caracteristici grafice, cum ar fi planurile de fază. Am stabilit o foaie de parcurs de dezvoltare pentru Escher-FBA (disponibilă pe pagina de pornire https://sbrg.github.io/escher-fba) și un proces iterativ de dezvoltare pentru a permite, în cele din urmă, analiza complexă a biologiei sistemelor în browserul web.
.