Etichetarea cu 18O: un instrument pentru proteomică

Se prezintă o evaluare a etichetării proteolitice și a cuantificării proteinelor în scopuri diagnostice folosind tripsina și H2O îmbogățit cu 18O. Demonstrăm că cuantificarea comparativă sau relativă poate fi realizată eficient cu această abordare. Am pus la punct un protocol care permite conservarea peptidelor marcate în apă cu abundență naturală fără teama schimbului invers, cu condiția ca pH-ul să fie suficient de scăzut pentru a stinge activitatea catalitică a tripsinei, dar nu atât de scăzut încât să favorizeze schimbul invers chimic. Deoarece eficiența marcării depinde de natura peptidei, nu există o relație liniară simplă între conținutul relativ al amestecului tampon de digerare 16O/18O (x) și eficiența marcării (y), ci mai degrabă o relație bazată pe probabilitate y = x(2). Ca atare, gradul de marcare a peptidelor folosind raporturile amestecului tampon de digerare 16O/18O se poate abate semnificativ de la cel așteptat pe baza unei relații liniare. Evaluarea eficienței relative a Ziptip a indicat o pierdere de recuperare a probei pe măsură ce concentrația peptidelor a fost redusă în condiții normale, sugerând că există o limită sub care randamentul scade. În plus, pierderile de adsorbție datorate uscării și recuperării Speedvac au indicat pierderi modeste (20 %) care pot varia foarte mult (0-50 %) de la peptidă la peptidă. Eficiența de digestie în soluție a amestecurilor standard de proteine în funcție de concentrație a arătat o scădere liniară odată cu scăderea concentrației. Acest lucru este în concordanță cu efectele cinetice ale enzimei și subliniază o potențială eroare de cuantificare care ar putea apărea atunci când se evaluează expresia diferențială bazată pe detectarea peptidelor. Rezultatele studiilor noastre demonstrează puterea marcării cu 18O ca instrument de optimizare pentru dezvoltarea proceselor proteomice.