Tabelul 1
Excitație, emisie și luminozitate
Dacă intenționați să utilizați mai multe etichete fluorescente, este important să alegeți una cu vârfuri de emisie distincte – precum și vârfuri de excitație pe care să le puteți ținti cu laserele disponibile. În cazul în care vârfurile de emisie se suprapun, va fi dificil, sau posibil imposibil, să le diferențiați.
În mod normal, doriți cea mai strălucitoare etichetă fluorescentă în cadrul spectrelor disponibile pentru a obține un semnal clar și pentru a depăși orice potențială fluorescență de fond. Valorile luminozității sunt un produs al coeficientului de extincție al proteinei și al randamentului cuantic. Cu toate acestea, numărul rezultat poate fi dificil de interpretat, prin urmare, luminozitatea unui marcaj fluorescent în raport cu un marcaj bine definit, cum ar fi EGFP, este o măsură alternativă obișnuită.
Maturarea și albirea
Maturarea definește cât timp îi ia unui marcaj fluorescent să se plieze corect, să formeze cromoforul și să înceapă să devină fluorescent. Pentru evenimentele sensibile la timp în celulele vii, un timp de maturare scurt poate fi important. Superfolder GFP (sfGFP), de exemplu, se poate plia în mai puțin de 10 minute, în timp ce mOrange poate dura peste patru ore.
Bleaching este o măsură a fotostabilității, adică în cât timp după excitare cromoforul își pierde capacitatea de a emite lumină. Dacă intenționați să efectuați experimente îndelungate de tip time-lapse, luați în considerare o etichetă cu o fotostabilitate ridicată. T-sapphire are un timp de înjumătățire de albire (t½; timpul pentru ca o rată de emisie inițială de x fotoni/s să se reducă la jumătate) de 25 de secunde, dar EGFP este mult mai stabilă, cu un t½ de albire de 174 de secunde.
Condiții de mediu
Ca majoritatea proteinelor, etichetele fluorescente sunt afectate de pH, temperatură și nivelurile de oxigen. În funcție de mediul pe care intenționați să îl utilizați, este posibil să trebuiască fie să ajustați ușor condițiile, fie să selectați un marker mai adecvat.
Ph-ul poate afecta vârfurile de excitație și emisie, iar majoritatea markerilor fluorescenți sunt sensibili la acizi: unii chiar își pot schimba intensitatea fluorescentă la modificări de pH (de exemplu, pHTomato). Valoarea pKa este un bun indicator al sensibilității la pH, deoarece arată pH-ul la care jumătate din cromofori sunt fluorescenți.
În plus, atât temperatura, cât și nivelurile de oxigen afectează timpii de maturare: condițiile hipoxice tind să întârzie timpii de maturare, la fel ca și temperaturile aflate în afara intervalului optim al markerilor fluorescenți (de exemplu, EGFP a fost optimizat pentru a funcționa la 37°C). Cu toate acestea, markerii fluorescenți mai noi, cum ar fi UnaG, o GFP izolată de la anghila japoneză de apă dulce (Anguilla japonica), este fluorescentă chiar și atunci când nivelurile de oxigen sunt scăzute3.
Optimizarea codonilor
Pentru că majoritatea markerilor fluorescenți sunt derivați din proteinele meduzelor sau ale coralilor, mai degrabă decât din ceva asemănător cu celulele și țesuturile mamiferelor în care este probabil să le folosiți, poate exista o diferență între specii în ceea ce privește codonii de aminoacizi utilizați. Acest lucru poate duce la o expresie slabă și, prin urmare, la un semnal scăzut.
Din fericire, multe dintre cele mai noi versiuni ale markerilor fluorescenți au fost optimizate din punct de vedere al codonilor pentru a reflecta preferințele celulelor mamiferelor. În cazul GFP, de exemplu, Jürgen Haas și colegii săi au îmbunătățit semnalul de 40-120 de ori prin modificarea secvenței de codoni GFP4.
Dacă folosiți o plasmidă mai veche pentru a genera proteinele de fuziune, este posibil ca aceasta să nu conțină o secvență de marker fluorescent modificată. Ca atare, verificați întotdeauna pentru a vedea dacă secvența dvs. a fost modificată pentru a fi utilizată la o anumită specie.
Oligomerizare
Este important să determinați dacă tag-ul dvs. este un monomer sau un dimer (monomerii sunt de obicei indicați printr-un „m” care prefixează numele proteinei, de exemplu mCherry) și dacă acest lucru afectează sau nu experimentul dvs. Multe dintre primele etichete fluorescente aveau tendința de a forma oligomeri, iar oligomerizarea poate afecta funcția biologică a proteinei de fuziune. EGFP, de exemplu, este un monomer care poate forma dimeri atunci când este utilizat în concentrații suficient de mari, ceea ce poate denatura organitele subcelulare5 sau perturba experimente precum FRET6. FP-urile cu adevărat monomerice sunt recomandate în marea majoritate a cazurilor.
Produsele GFP și mCherry
.