Populația studiată
Acest studiu se bazează pe cohortele HAPIEE (Health, Alcohol and Psychosocial factors in Eastern Europe) din Polonia, Republica Cehă și Lituania , precum și pe urmărirea timp de 8 ani a cohortei germane ESTHER (denumire germană: „Epidemiologische Studie zu Chancen der Verhütung, Früherkennung und optimierten Therapie chronischer Erkrankungen in der älteren Bevölkerung”) .
Studiul HAPIEE total cuprinde cohorte din patru țări. Deoarece nu a fost posibil să se exporte probe de sânge din Rusia, doar trei cohorte au fost incluse în analiza actuală. Participanții la studiu au fost recrutați în șase orașe cehe (Havirov/Karvina, Hradec Kralove, Jihlava, Kromeriz, Liberec și Usti nad Labem) în perioada 2002-2005 (n = 8.857), în Cracovia, Polonia, în perioada 2002-2005 (n = 10.728) și în Kaunas, Lituania, în perioada 2006-2008 (n = 7.161). Fiecare cohortă este formată dintr-un eșantion aleatoriu de bărbați și femei, cu vârste cuprinse între 45 și 75 de ani la momentul inițial, stratificat pe sexe și pe grupe de vârstă de 5 ani, selectat din registrele populației. Rata globală de răspuns a fost de 61 % . Datele au fost colectate prin intermediul unui chestionar și a unei scurte examinări într-o clinică în timpul căreia a fost prelevată o probă de sânge venos la post.
Studiul ESTHER este o cohortă bazată pe populație de 9.949 de adulți, cu vârsta de 50-74 de ani la momentul inițial, recrutați de către medicii lor de familie (GP) în timpul unui control de sănătate de rutină între 2000 și 2002 în statul federal german Saarland . Investigația actuală se bazează pe urmărirea de 8 ani, realizată între iulie 2008 și decembrie 2010, la care participanții la studiu aveau între 56 și 85 de ani. De la momentul inițial până la urmărirea de 8 ani, 499 de persoane au decedat, 505 persoane nu au mai putut participa din cauza stării de sănătate precare, iar 680 au refuzat să mai participe. Dintre cei 8 265 de participanți rămași, 6 061 au trimis înapoi un chestionar (rata de răspuns, 73,4 %) și 4 637 au donat o probă de sânge în cabinetul medicului lor de familie. Medicii de familie ai participanților la studiu au completat, de asemenea, un chestionar privind starea de sănătate a participanților la studiu (disponibil pentru n = 5.997). În plus, 3.124 de participanți la studiu au consimțit la o evaluare geriatrică suplimentară de 3 ore, efectuată de medicii studiului la domiciliul participanților.
Variabilele din studiile ESTHER și HAPIEE au fost armonizate și markerii de stres oxidativ au fost măsurați în cadrul Consorțiului privind sănătatea și îmbătrânirea: Network of Cohorts in Europe and the United States (CHANCES; www.chancesfp7.eu), care a fost descris în altă parte . Studiile sunt efectuate în conformitate cu declarația de la Helsinki și s-a obținut consimțământul informat în scris de la toți participanții la studiu.
Etică, consimțământ și permisiuni
Studiile incluse au fost aprobate de comitetele locale de etică respective (ESTHER: Facultatea de Medicină a Universității din Heidelberg și Asociația Medicală din Saarland; HAPIEE: University College London (Marea Britanie), Institutul Național de Sănătate Publică (Praga, Republica Cehă), Universitatea Jagielloniană (Cracovia, Polonia) și Universitatea Lituaniană de Științe ale Sănătății (Kaunas, Lituania)). Consimțământul informat în scris a fost obținut de la toți participanții incluși în studiile analizate, iar studiile se desfășoară în conformitate cu Declarația de la Helsinki.
Evaluarea covariatelor
În studiile ESTHER și HAPIEE, datele sociodemografice, stilul de viață și istoricul bolii au fost evaluate prin chestionare autoadministrate. Înălțimea și greutatea au fost măsurate și completate cu informații auto-raportate în ESTHER pentru acei participanți la studiu care nu și-au dat consimțământul pentru vizita la domiciliu. În plus față de informațiile auto-raportate, istoricul bolilor cronice comune a fost validat în cadrul studiului ESTHER prin consultarea fișelor medicale sau a registrului de cancer din Saarland. Insuficiența renală a fost definită de o rată de filtrare glomerulară estimată <60 ml/min/1,73 m2, calculată cu ecuația Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration bazată pe creatinină . În cohorta ESTHER, concentrațiile de creatinină serică au fost evaluate cu o metodă cinetică Jaffé pe un Cobas 8000 C701 (analit: CREJ2 3000, Roche). Colesterolul total și colesterolul lipoproteic cu densitate mare (HDL) au fost evaluate în probele de ser prin cromatografie enzimatică (analiți: Chol2 2100, HDLC3 450, Roche) și proteina C reactivă (CRP) prin imunoturbidimetrie pe Cobas 8000 C701 (analit: CRPL3 500, Roche). În HAPIEE, colesterolul total și HDL au fost, de asemenea, evaluate cu aceeași metodologie de analiză și analiți Roche, dar au fost utilizate autoanalizatoare diferite (HAPIEE Republica Cehă și Lituania: Roche Cobas Mira; HAPIEE Polonia: Hitachi 917/Modular P). În plus, în toate cohortele HAPIEE, creatinina serică și CRP au fost evaluate cu aceeași metodologie de analiză ca în ESTHER, dar cu analiți de la un furnizor diferit (Beckman-Coulter) și pe un autoanalizator diferit (LX-20 Pro, Beckman-Coulter).
Constatarea mortalității
Pentru aceste analize, am utilizat urmărirea mortalității totale prin registrele oficiale de mortalitate la nivel național (Republica Cehă, Germania), local (Lituania) sau regional (Polonia) până la 31 decembrie 2010, în Polonia, 31 decembrie 2011, în Republica Cehă și Lituania, și până la 31 iulie 2014, în Germania. Mortalitatea în funcție de cauză în Germania a fost disponibilă doar pentru decesele care au avut loc până la 2 aprilie 2013. Registrele au fost complete pentru toți participanții care nu s-au mutat în afara regiunii acoperite de registru. Pierderea monitorizării din cauza migrației a fost de 4 % în cohortele HAPIEE (combinate) și de 2 % în studiul ESTHER. Toate decesele codificate cu codurile ICD-10 I00-I99 au fost considerate decese cardiovasculare, iar decesele prin cancer au fost definite prin codurile ICD-10 C00-C97.
Măsurarea markerilor serici de stres oxidativ
Analizele utilizate pentru măsurarea nivelurilor d-ROMs (Diacron, Grosseto, Italia) și TTL (Rel Assay Diagnostics, Gaziantep, Turcia) au fost adaptate la un autoanalizator (LX20-Pro, Beckman-Coulter, Woerden, Olanda) la Laboratorul de Cercetare pentru Protecția Sănătății (Bilthoven, Olanda), așa cum a fost descris anterior . Testul d-ROMs măsoară concentrația de hidroperoxid în unități Carratelli (Carr U), denumite după inventatorul testului, Mauro Carratelli. Fiecare Carr U corespunde la 0,08 mg de peroxid de hidrogen (H2O2)/100 ml în probă . Testul TTL măsoară concentrația de grupări tiolice libere din probă în μmol/L.
Măsurătorile au fost efectuate în probe de ser care au fost stocate timp de aproximativ 3-10 ani în congelatoare cu -80 °C. d-ROM și TTL au o bună stabilitate pe termen lung în aceste condiții . În cadrul urmăririi ESTHER la 8 ani, d-ROMs și TTL au fost măsurate la toți participanții care au donat probe de sânge la cabinetul medicului de familie (n = 4.637). Cu toate acestea, măsurătorile au fost efectuate la două momente de timp diferite, deoarece nu au fost disponibile fonduri pentru a măsura toate probele în cadrul studiului pilot efectuat în iunie 2012 . Pentru a corecta eventualele modificări ale testelor, 80 de probe din punctul de timp 1 (iunie 2012) au fost măsurate din nou la punctul de timp 2 (septembrie 2014) și s-au obținut ecuații de regresie liniară care au fost utilizate pentru a standardiza rezultatele din punctul de timp 2 la nivelurile din punctul de timp 1, când au avut loc și măsurătorile în cohortele HAPIEE (pe tot parcursul anului 2012). Acordul dintre măsurătorile d-ROMs a fost ridicat (coeficientul de corelație Spearman r = 0,92 și diferența mediilor = 15 Carr U) și, prin urmare, nu s-au aplicat corecții. Pentru TTL, o deplasare evidentă a rezultatelor analizei (r = 0,88 și diferența mediilor = 81 μmol/L) a fost corectată prin aplicarea următoarei ecuații la toate măsurătorile din punctul de timp 2: TTL-timp-punct2 = 0,746 × TTL-timp-punct1. În plus, am exclus 610 măsurători în probele de sânge care nu au îndeplinit criteriile stricte de calitate hemolitică, icterică și lipemică din studiul ESTHER, rămânând 4 027 pentru analiza din prezentul studiu. În cohortele HAPIEE, numărul de eșantioane care nu au îndeplinit aceste criterii de calitate a fost neglijabil.
Eșantion de studiu analitic
Din cauza finanțării limitate, nivelurile de d-ROMs și TTL nu au fost măsurate la toți participanții din cohortele HAPIEE; în schimb, a fost adoptat un design de control de caz împerecheat (Fișier suplimentar 1: Figura S1). Cazurile au fost definite ca fiind toți subiecții care au decedat în timpul urmăririi (n = 1.433) sau care au suferit un infarct miocardic (IM) sau un accident vascular cerebral (AVC) incident non-fatal (n = 658). Controalele (n = 4,396) au fost potrivite ca frecvență cu cazurile în funcție de sex și grupuri de vârstă de 5 ani. Pentru a corecta supraeșantionarea pentru infarct miocardic și accident vascular cerebral în această analiză a mortalității, subiecții cu infarct miocardic non-fatal sau accident vascular cerebral non-fatal în timpul urmăririi au fost excluși din cazuri într-o primă etapă. Pentru a adăuga la controale un eșantion reprezentativ de subiecți cu IM sau accidente vasculare cerebrale incidente non-fatale, într-o a doua etapă, a fost calculată proporția observată de IM sau accidente vasculare cerebrale incidente non-fatale în fiecare strat specific vârstei și sexului din cohorta totală. Într-o a treia etapă, aceste proporții au fost înmulțite cu dimensiunile eșantioanelor din fiecare strat în cadrul controalelor cu markeri de stres oxidativ măsurați. Într-o a patra etapă, numerele rezultate au fost selectate în mod aleatoriu în fiecare strat din grupul de subiecți cu infarct miocardic sau accident vascular cerebral incident non-fatal și adăugate la controale, rezultând un grup de 4.552 de controale eligibile pentru cele 1.433 de decese. În etapa finală, grupul de controale eligibile a fost utilizat pentru a potrivi individual exact două controale pentru fiecare deces în funcție de cohortă, sex și vârstă (±5 ani).
Analize statistice
Diferențele în caracteristicile de bază între cazuri (deces în timpul urmăririi) și controale au fost evaluate cu testul χ2 pentru variabilele categorice și testul Wilcoxon rank-sum pentru variabilele continue. Asocierile transversale ale factorilor de risc stabiliți pentru mortalitate cu niveluri ridicate de stres oxidativ au fost evaluate cu modele de regresie logistică cuprinzând toate caracteristicile de bază modelate ca variabile categorice (tabelul 1). Variabila dependentă „stres oxidativ ridicat” a fost definită prin două definiții diferite bazate pe nivelurile d-ROMs sau TTL. Pentru d-ROMs, în conformitate cu instrucțiunile producătorului, a fost utilizat un cut-off clinic de >400 Carr U, care a clasificat 23 % din cohorta ESTHER și 30 % din controalele eligibile din cohorta HAPIEE în categoria de stres oxidativ „ridicat”. Pentru TTL, nu sunt disponibile cut-off-uri clinice și, deoarece testul nu este încă standardizat, mediile populației au variat puternic între cohorte. Prin urmare, pentru a se potrivi cu proporția de indivizi cu stres oxidativ ridicat obținută prin definiția bazată pe nivelurile de d-ROMs, s-a utilizat ultima cuartilă TTL specifică cohortei (25 %) pentru a clasifica subiecții într-o categorie de stres oxidativ ridicat pe baza TTL. Analizele transversale au fost efectuate la toți subiecții și separat pentru femei și bărbați.
Pentru analizele longitudinale, Regresia proporțională a hazardului Cox (cohorta ESTHER) și regresia logistică condiționată (studiul de caz-controlaj împerecheat HAPIEE) au fost utilizate pentru a estima rapoartele de hazard și, respectiv, cotele de șanse pentru o creștere a nivelurilor d-ROMs și o scădere a TTL cu o deviație standard (SD) specifică cohortei. În plus, nivelurile d-ROMs au fost, de asemenea, modelate ca o variabilă categorială, cu cut-off-uri clinice recomandate de producător pentru stresul oxidativ moderat (341-400 Carr U), ridicat (401-500 Carr U) și foarte ridicat (>500 Carr U), cu referire la subiecții cu stres oxidativ nu crescut sau scăzut (≤340 Carr U). Atunci când riscul absolut este scăzut, regresia logistică și regresia Cox produc, de obicei, rezultate similare, iar raportul de probabilitate poate fi considerat ca o aproximare a raportului de risc mai precis. Am utilizat termenul de risc relativ (RR) pentru ambele estimări ale efectului. În cadrul analizei de sensibilitate, analizele privind mortalitatea specifică cauzei în cohorta ESTHER au fost efectuate luând în considerare riscul concurent de deces datorat altor cauze prin ajustarea unui model de regresie cu hazard de subdistribuție proporțională cu ponderi pentru subiecții care au suferit evenimentul cu risc concurent în conformitate cu o extensie a metodei Fine și Gray . Cu toate acestea, rezultatele au fost aproape identice cu regresia tradițională a hazardurilor proporționale Cox și, prin urmare, doar aceste din urmă rezultate sunt prezentate în acest manuscris.
Analizele au fost efectuate separat pentru fiecare cohortă și grupate prin meta-analiză cu ponderare Mantel-Haenszel și efecte aleatorii , luând în considerare dimensiunea eșantionului cohortelor și posibilitatea eterogenității statistice între studii. Aceasta din urmă a fost examinată cu ajutorul testului Q al lui Cochrane și al statisticii I2.
Au fost analizate următoarele rezultate: mortalitatea din toate cauzele, din cauza bolilor cardiovasculare, a cancerului și din cauze non-CVD, altele decât cancerul. Pentru fiecare rezultat, au fost elaborate patru modele statistice, cu o includere din ce în ce mai mare a factorilor de risc de mortalitate stabiliți în modele. Atât nivelurile d-ROMs, cât și TTL au fost întotdeauna incluse în același model, deoarece corelația lor a fost scăzută (r <0,08 în fiecare cohortă). În modelul 1, s-a efectuat o ajustare pentru vârstă și sex în cohorta ESTHER, în timp ce acest lucru nu a fost necesar pentru cohortele HAPIEE, deoarece cazurile au fost împerecheate individual cu două controale în funcție de vârstă și sex și analizate în cadrul unei analize stratificate în care straturile constau în colecția de seturi împerecheate. Modelul 2 a ajustat în plus pentru educație, indicele de masă corporală (IMC), fumat, consum de alcool și activitate fizică. Modelul 3 a inclus, de asemenea, bolile care ar putea media asocierea stresului oxidativ cu mortalitatea (adică dislipidemia (evaluată prin colesterolul total și HDL), insuficiența renală, antecedente de diabet, hipertensiune arterială, IM, accident vascular cerebral și cancer). În cele din urmă, modelul 4 a fost ajustat suplimentar pentru nivelurile CRP, care au fost puternic corelate cu nivelurile d-ROMs (r = 0,34-0,41 în cohorte) și, mai puțin puternic, cu TTL (r = 0,11-0,17 în cohorte). Vârsta a fost modelată ca o variabilă continuă și toate celelalte variabile au fost modelate ca variabile categorice (categoriile sunt prezentate în tabelul 1). Am testat interacțiunile dintre d-ROMs/TTL cu covariatele prin adăugarea unor termeni de interacțiune corespunzători la modelul 2.
Subgrupurile care urmează să fie analizate au fost alese a priori cu scopul de a stratifica pentru cei mai importanți determinanți potențiali ai nivelurilor ridicate de stres oxidativ: cohortă/țară, vârstă, sex, antecedente de IM sau cancer și stare inflamatorie. Din cauza limitărilor legate de dimensiunea eșantionului, analizele stratificate au fost limitate la mortalitatea din toate cauzele, MCV și cancer. Pentru a aborda posibilitatea unei distorsiuni de cauzalitate inversă , analizele au fost efectuate separat pentru evenimentele care au avut loc în anii 1-2, anii 3-4 și anii 5-6 de urmărire. Din cauza limitărilor privind dimensiunea eșantionului, această analiză stratificată a putut fi efectuată numai pentru mortalitatea din toate cauzele. Pentru a evita instabilitatea modelului, rezultatul analizei unui subgrup specific cohortei a fost luat în considerare pentru meta-analiză numai atunci când au avut loc cel puțin 25 de evenimente în subgrup.
A fost utilizată imputarea multiplă pentru a imputa numărul de valori lipsă ale covariatelor de bază prezentate în Fișierul suplimentar 1: Tabelul S1. Proporția de valori lipsă a fost sub 5 % pentru toate variabilele, cu excepția consumului de alcool și a activității fizice, care au avut până la 22 % de valori lipsă. Din cunoștințele noastre, datele au lipsit la întâmplare, ceea ce reprezintă ipoteza imputației multiple. Separat pe cohortă, statut de caz și sex, 20 de seturi complete de date au fost imputate cu procedura SAS 9.3 „PROC MI”, utilizând metoda Markov chain Monte Carlo. Variabilele din modelul „complet” au fost utilizate pentru modelul de imputare. Toate analizele multivariabile au fost efectuate în cele 20 de seturi de date imputate, iar rezultatele seturilor de date individuale au fost combinate prin procedura SAS 9.3 „PROC MIANALYZE”.
Meta-analizele au fost efectuate cu software-ul statistic Comprehensive Meta-Analysis 2.0 (Biostat, Englewood, NJ, SUA). Toate celelalte analize au fost efectuate cu SAS, versiunea 9.2 (Cary, Carolina de Nord, SUA). Toate testele statistice au fost bilaterale, utilizând un nivel alfa de 0,05.
.