Isolation and Identification of Volatiles
Ihmisen nenä aistii monet haihtuvat orgaaniset yhdisteet hajuina, ja nämä hajut ovat usein ensimmäinen merkkimme siitä, että homeet ovat läsnä. VOC-yhdisteiden kemiallinen karakterisointi (eristäminen, erottaminen, tunnistaminen ja kvantifiointi) edellyttää kuitenkin erikoistuneita analyysimenetelmiä, jotka eroavat perinteisessä ”märkäkemiassa” käytetyistä lähestymistavoista. Teknologiset edistysaskeleet 1900-luvun lopulla ja 2000-luvun alussa ovat parantaneet kykyämme havaita haihtuvat aineet tarkasti, täsmällisesti ja pieninä pitoisuuksina (Zhang ja Li, 2010; Hung et al., 2015). Lyhyesti sanottuna perinteisiin menetelmiin kuuluu höyrytislaus ja neste-nesteuutto, jonka jälkeen yksittäiset yhdisteet konsentroidaan ja tarkistetaan kemiallisesti. Joissakin varhaisimmissa VOC-yhdisteiden kemiallista luonnetta koskevissa tutkimuksissa käytettiin metyleenikloridiuutteita, jotka väkevöitiin höyrytislauksella ja analysoitiin kaasunestekromatografialla ja massaspektrometrialla (MS). Varhaisessa tutkimuksessa, jossa käytettiin tätä menetelmää, analysoitiin Aspergillus nigerin, Aspergillus ochraceuksen, Aspergillus oryzaen ja Aspergillus parasiticuksen VOC-yhdisteet. Kaikki neljä lajia tuottivat 3-metyylibutanolia, 3-oktanonia, 3-oktanolia, 1-okten-3-olia, 1-oktenolia ja 2-okten-1-olia. A. nigerin osalta yli 90 prosenttia tunnistetusta VOC-seoksesta koostui 1-okten-3-olista, joka on hajuyhdiste, joka antaa sienille niiden ominaishajun. A. parasiticus -sienessä 1-okteeni-3-oli oli 35,6 % haihtuvien yhdisteiden kokonaisseoksesta, kun taas sukua oleva kahdeksanhiilinen yhdiste, 2-okteeni-1-oli, jolla on epämiellyttävä multaisen öljyn haju, muodosti 34,8 % (Kamiński et al., 1974).
Menetelmät ovat sittemmin perustuneet kaasukromatografia-massaspektrometriaan (GC-MS), jossa yhdistyvät kromatografinen erottelu, tunnistaminen massaspektrin ja kromatografisen retentioasteen perusteella sekä haihtuvien näytteiden kvantifiointi. Sieniviljelmien headspace-tilassa olevat haihtuvat orgaaniset yhdisteet kerätään yleensä kiinteillä sorptiomateriaaleilla, kuten aktiivihiilellä tai kuidulla. Jokaisella keräysmenetelmällä on luontaisia vääristymiä, ja se voi aiheuttaa artefaktin muodostumista; yleensä poolittomat yhdisteet kerätään mieluummin kuin pooliset yhdisteet. Kaasukromatografia voi myös aiheuttaa virheitä, sillä joskus on vaikea erottaa kahta yhdistettä toisistaan, mikä johtaa niiden sekoittumiseen. Tämä on havaittu 2-metyyli-1-butanolin ja 3-metyyli-1-butanolin tapauksessa, jotka ovat isomeerejä, jotka eroavat toisistaan vain yhden metyyliryhmän siirtymisen osalta (Börjesson et al., 1992). Muita GC-MS-analyysin haittapuolia ovat ammattitaitoisen käyttäjän tarve, sen suhteellinen kalleus ja se, että se ei ole tehokas reaktiivisempien VOC-yhdisteiden kanssa (Elke et al., 1999; Gao et al., 2002; Gao ja Martin, 2002; Rappert ja Müller, 2005).
Kiinteäfaasimikroekstraktio (SPME) on suosittu ja kannettava menetelmä. VOC-yhdisteet absorboidaan ja konsentroidaan ensin kuituun ja toimitetaan myöhemmin detektoriin, jossa desorptio tapahtuu itse GC-injektorissa. SPME soveltuu hyvin ympäristönäytteiden ottamiseen, jotka sitten kuljetetaan takaisin laboratorioon tunnistusta varten. Yhdessä GC-MS:n kanssa se on kätevä ja laajalti käytetty keino VOC-yhdisteiden kvalitatiiviseen tunnistamiseen mikrobiviljelmistä tai saastuneista rakennuksista (Fiedler et al., 2001; Wady et al., 2003; Jeleń ja Grabarkiewicz-Szczesna, 2005). SPME on usein paras lähestymistapa, kun halutun haihtuvan yhdisteen suhteellinen määrä määritetään tutkimustilanteessa tai toistuvissa näytteenottoprosesseissa. Se ei kuitenkaan ole käyttökelpoinen uusien yhdisteiden tunnistamiseen.
On kehitetty monia erikoistuneita analyysimenetelmiä, jotka täydentävät klassisia GC-MS-menetelmiä ja voivat olla hyödyllisiä kohdennetuissa analyyseissä. Esimerkiksi protoninsiirtoreaktio-massaspektrometria (PTR-MS) on hyödyllinen nopeassa näytteenotossa ja pienten pitoisuuksien havaitsemisessa (Kamysek et al., 2011; Schwoebel et al., 2011). Menetelmää on käytetty ympäristötieteissä, elintarviketeknologiassa ja lääketieteellisessä diagnostiikassa (Gasperi et al., 2001; Cappellin et al., 2013).
Käyttämällä termistä desorptiota (TD)-kaasukromatografiaa/massaspektroskopiaa Aspergillus fumigatusin haihtuvien metaboliittien in vitro -profiilia on luonnehdittu, ja se on osoittanut, että siinä on erottuva allekirjoitus, joka sisältää monoterpeenejä kampfeenin, α- ja β-pineenin ja limoneenin; ja seskviterpeeniyhdisteiden α- ja β- trans-bergamoteenin (Koo et al., 2014).
Valikoiduilla ionivirtausputki-massaspektrometrialla (SIFT-MS) voidaan havaita mikrobiperäisiä VOC-yhdisteitä nopeasti ja herkästi kohtalaisen monimutkaisesta kaasuseoksesta. Se pystyy kohdistamaan VOC-yhdisteet pieniin miljardin osan pitoisuuksiin ja voi mitata tiettyjä yhdisteitä miljardin osan alueella. Tässä tekniikassa kaikki VOC-yhdisteet ionisoituvat virtausputkessa, eikä kromatografista erottelua tarvita (Syhre et al., 2008; Chambers et al., 2011). Menetelmää on käytetty A. fumigatus -bakteerin tuottamien VOC-yhdisteiden kvantifiointiin kokoviljelmässä bakteerien kanssa, joita esiintyy usein sairaissa ihmisen keuhkoissa. A. fumigatus -bakteerin viljelmät tuottivat ”runsaasti” ammoniakkia ja orgaanisia rikkiyhdisteitä metanetiolia (tunnetaan myös nimellä metyylimerkaptaani), dimetyylisulfidia ja dimetyylidisulfidia (Chippendale et al., 2014).
Simultaaninen tislausuutto (SDE) sisältää lyhyen orgaanisella materiaalilla päällystetyn silikakuidun pysyvänä faasina, joka konsentroi VOC-yhdisteitä, jotka desorboituvat sen jälkeen kuumassa injektorissa. SDE:tä on käytetty haihtuvien komponenttien määrittämiseen ympäristö-, elintarvike-, rikosteknisissä, öljy-, lääke- ja polymeerianalyyseissä konsentroitujen näytteiden saamiseksi (Orav et al., 1996). Esimerkiksi tiettyjä aromiyhdisteitä on tutkittu käyttämällä SDE:n ja SPME:n yhdistelmää. Aromiyhdisteitä voidaan analysoida kvantitatiivisesti SDE:llä, kun taas SPME:tä käytetään yksinkertaiseen, nopeaan ja rutiininomaiseen seulontaan (Cai et al., 2001).
Multikapillaarisen pylväs-ioniliikkuvuusspektrometrin (Multicapillary column-ion mobility spectrometer, MCC-IMS) herkkyys yltää biljoonaosien alueeseen, se on nopea, ja se vaatii vähäistä teknistä osaamista. A. fumigatus- ja Candida-lajien tyypilliset aineenvaihduntatuotteet on pystytty erottamaan päänavaruusanalyysissä tällä menetelmällä (Perl ym., 2011).
Elektroniset nenät (e-noses) muuttavat haihtuvat aineet sähköisiksi signaaleiksi, jotka perustuvat vuorovaikutukseen elektronisten pintojen kanssa, ja niitä voidaan käyttää tunnettujen yhdisteiden havaitsemiseen. E-nenät koostuvat ryhmästä kemiallisia antureita, joilla on erilainen selektiivisyys, signaalin esikäsittelyyksiköstä ja kuvioiden erottelujärjestelmästä (Gardner ja Bartlett, 1994). Eri VOC-yhdisteet muodostavat tyypillisen sormenjäljen, joka voidaan erottaa vertaamalla sitä tunnistusjärjestelmään aiemmin tallennettuihin kuvioihin. Sähköisten nenien lääketieteelliset sovellukset keskittyivät alun perin bakteeripatogeeneihin tai muihin kuin infektiosairauksiin, kuten keuhkosyöpään, krooniseen obstruktiiviseen keuhkosairauteen ja astmaan (Valera et al., 2012). Sovelluksesta riippuen diagnostisiin tarkoituksiin käytetään VOC-näytteitä pyyhkäisynäytteistä, ysköksestä, seerumista, ulosteista, hengityksestä tai virtsasta. Hengitysnäytteitä on käytetty aspergilloosin varhaiseen havaitsemiseen (de Heer ym., 2013).
Sienten VOC-yhdisteiden kanssa työskentelyyn liittyy edelleen monia teknisiä haasteita, ja eri laboratorioiden välillä saatujen tulosten vertailu on usein vaikeaa. Samoilla sienilajeilla voi olla erilaisia VOC-profiileja, jotka perustuvat tuntemattomiin tai kontrolloimattomiin ympäristö- ja geneettisiin tekijöihin. Lisäksi käytetty koeprotokolla voi vaikuttaa merkittävästi VOC-profiiliin. Esimerkiksi de Lucca et al. (2010) havaitsivat Aspergillus flavus -bakteeria koskevassa työssään vain yhden terpeenin, kun he käyttivät SPME:tä haihtuvien aineiden keräämiseen ennen GC-MS:ää. Myöhemmin ryhmä pystyi havaitsemaan useita terpeenejä, kun se käytti näytekonsentraattoria ennen GC-MS:n toimittamista toiseen GC-MS-laitemalliin (de Lucca et al., 2012). Materiaalien käsittelytapa ennen kokeita voi aiheuttaa artefakteja, ja autoklavointi voi aiheuttaa ei-biogeenisten haihtuvien aineiden muodostumista (Börjesson et al., 1992). Koska tiedot ovat usein epäjohdonmukaisia eri kokeissa, jotkut kirjoittajat ovat kyseenalaistaneet mikrobiologisten VOC-päästöjen toistettavuuden (Schleibinger et al., 2002). Tulevassa sieniperäisiä VOC-päästöjä koskevassa työssä on otettava huomioon monet tekijät, jotka voivat vaikuttaa tuloksiin. Olisi hyödyllistä, jos sienistä peräisin olevia VOC-yhdisteitä tutkivien tiedemiesten yhteisö kehittäisi ohjeita parhaita käytäntöjä varten.