Proteiinien 130 ja 131 tunnistaminen, karakterisointi ja todentaminen 14-3-3-3:ksi
Kuva 1. Aivoproteiini 14-3-3 aivo-selkäydinnesteessä.
Kuva 1. Hopeakyllästettyjen geelien alueet, joissa näkyy proteiinipaikat 130 ja 131 kaksiulotteisen elektroforeesin jälkeen.
Paneelissa A on normaali aivo-selkäydinneste, jossa ei ole täpliä 130 ja 131. Paneelissa B on Creutzfeldt-Jakobin tautia sairastavan potilaan aivo-selkäydinnestettä; nuolet osoittavat pisteisiin 130 ja 131. Taulujen C ja D geelit ovat normaalista ihmisen aivoista otetusta uutteesta. Paneeleissa A, B ja C näkyy sama geelialue, jonka isoelektriset pisteet vaihtelevat x-akselilla välillä 4,8-6,0 (vasemmalta oikealle) ja koot vaihtelevat y-akselilla välillä 10-40 kd (alhaalta ylös). Paneelin C katkoviivoitettu laatikko hahmottaa paneelissa D näkyvän alueen geelistä, jonka pH-alue on 4,5-5,4. Nuolet paneeleissa B ja C osoittavat täplien 130 ja 131 sijainnin, jotka on merkitty paneelissa D.
Kaksiulotteisen elektroforeesin tulokset aivo-selkäydinnesteen proteiinien 130 ja 131 havaitsemiseksi Creutzfeldt-Jakobin tautia sairastavilla potilailla on esitetty kuvissa 1A ja 1B. Viimeaikaiset tekniset parannukset ovat lisänneet resoluutiota, ja alun perin kuvattujen kahden (proteiineja 130 ja 131 vastaavan) pisteen sijasta on nyt kuusi pistettä. Löytääksemme näiden proteiinien runsaan lähteen tutkimme normaalia aivokudosta selvittääksemme, sijaitseeko aivojen proteiineja lähellä aivo-selkäydinnesteen proteiineja 130 ja 131 vastaavien täplien yhdistelmää. Kuvassa 1C esitetään alue hopeavärjätystä geelistä normaalien aivoproteiinien kaksiulotteisen elektroforeesin jälkeen. Useat proteiinit näkyvät samalla alueella kuin 130-131-konstellaatio, mukaan lukien kaksi proteiinia, joilla on sama varaus ja massa kuin aivo-selkäydinnesteen 130-131-konstellaatiolla. Näiden kahden pisteen tunnistaminen niiden sijainnin perusteella vahvistettiin komigraatiotutkimuksilla. Pilkku 130 puhdistettiin kapea-alaisella kaksiulotteisella elektroforeesilla (pH-alue 4,5-5,4), kuten kuvassa 1D on esitetty.
Pilkku 130 leikattiin pois 10:stä blotista, pilkottiin entsymaattisesti ja mikrosekvensoitiin. Aminohapposekvenssit saatiin neljästä peptidifragmentista. Kolme näistä sekvensseistä, Val-Thr-Glu-Leu-Asn-Glu-Pro-Leu-Xaa-Asn-Glu-Asp-Xaa-Asn-Leu-Leu-Ser-Val-Ala, Asp-Tyr-Tyr-Xaa-Tyr-Leu-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Gly-Glu-Lys ja Asn-Val-Val-Val-Xaa-Ala-Arg-Arg-Ser-Ser-Ser-Xaa-Arg-Arg-Val-Ile-Ser-Ser-Ser-Ser-Ile-Glu-Gln, sopivat yhteen ihmisen 14-3-3-proteiinien isomuodon eta sekvenssin kanssa. Neljäs sekvenssi, Tyr-Ser-Glu-Ala-Xaa-Glu-Ile-Ser, vastasi naudan 14-3-3-proteiinin isoformia gamma.
14-3-3-vasta-aine reagoi spesifisesti aivo-selkäydinnesteen proteiinien 130 ja 131 kanssa kaksiulotteisessa elektroforeettisessa immunoblotissa, mutta ei reagoinut muiden aivo-selkäydinnesteen proteiinien kanssa, mikä varmisti, että aivo-selkäydinnesteen proteiinit 130 ja 131 ovat 14-3-3-proteiineja.
14-3-3-immunomääritys
Kuva 2. 14-3-3-3-immunomääritys.
Kuva 2. Anti-14-3-3β-polyklonaalisen kanin vasta-aineen immunovärjäys natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesin jälkeen.
Kaistalla 1 on aivo-selkäydinnestettä potilaalta, jolla on patologisia todisteita Alzheimerin taudista, kaistoilla 2 ja 3 on aivo-selkäydinnestettä kahdelta Creutzfeldt-Jakobin tautia sairastavalta potilaalta, kaistalla 4 on aivo-selkäydinnestettä normaalilta lehmältä, kaistalla 5 on aivo-selkäydinnestettä lehmältä, jolla on kokeellisesti aikaansaatu tartuntakykyinen minkin enkefalopatia ja patologisia todisteita spongiformisesta taudista, kaistalla 6 on normaali ihmisen seerumi, kaistalla 7 Creutzfeldt-Jakobin tautia sairastavan potilaan seerumi, kaistalla 8 normaaleista ihmisen aivoista saatu uute ja kaistalla 9 Creutzfeldt-Jakobin tautia sairastavan potilaan aivoista saatu puhdistettu prioniproteiini.
Havainto, että aivo-selkäydinnesteen 30 kd-pisteet (proteiinit 130 ja 131) ovat 14-3-3-proteiineja, johti yksinkertaisen immunomäärityksen kehittämiseen tarttuvan spongiformisen enkefalopatian diagnosoinnin avuksi. Kuten kuvasta 2 käy ilmi, Creutzfeldt-Jakobin tautia sairastavien potilaiden aivo-selkäydinnesteessä oli 30 kd:n immunoreaktiivinen kaistale (kaistat 2 ja 3), kun taas terveiden kontrollien aivo-selkäydinnesteessä (tietoja ei ole esitetty) tai Alzheimerin tautia sairastavan potilaan aivo-selkäydinnesteessä (kaista 1) ei havaittu tällaista kaistaa. Odotetusti 14-3-3 oli runsaasti normaalien ihmisaivojen uutteessa (kaista 8). 14-3-3-proteiinia ei löytynyt normaalista seerumista (kaista 6); sitä ei kuitenkaan havaittu myöskään Creutzfeldt-Jakobin tautia sairastavien potilaiden seerumista (kaista 7). Creutzfeldt-Jakobin tautia sairastavan potilaan aivoista puhdistettu prioniproteiini (kaista 9) ei reagoinut ristiin 14-3-3-vasta-aineen kanssa, mikä vahvisti, että 14-3-3 ei ole prioniproteiini.
Taulukko 1. Prioniproteiini.
Taulukko 1. 14-3-3-immunomäärityksellä arvioidut aivo-selkäydinnestenäytteet diagnoosin mukaan. Taulukko 2.
Taulukko 2. 14-3-3-immunomäärityksen herkkyys ja spesifisyys Creutzfeldt-Jakobin taudin suhteen.
Creutzfeldt-Jakobin tautia sairastavien potilaiden 71 aivo-selkäydinnestenäytteestä 68 (96 prosenttia) oli 14-3-3-positiivisia (taulukko 1 ja taulukko 2). Neljä 94 näytteestä (4 prosenttia), jotka olivat peräisin potilailta, joilla oli muita dementiaa aiheuttavia sairauksia, oli positiivisia 14-3-3:n suhteen (taulukko 1 ja taulukko 2) (P<0,001). Lisäksi kun analyysistä jätettiin pois dementiapotilaat, joilla tiedettiin olleen akuutti aivoinfarkti kuukauden sisällä ennen testausta, vain yksi näytteistä 91:stä (1 prosentti) oli positiivinen (P<0,001). Kaikkien 10 potilaan näytteet, joilla oli moni-infarktinen dementia, mutta joilla ei ollut aivohalvausta testiä edeltävän kuukauden aikana, olivat negatiivisia 14-3-3:n suhteen. Muiden dementiapotilaiden aivo-selkäydinnestenäytteiden ainoa väärä positiivinen tulos oli peräisin potilaalta, jolla oli kliininen Alzheimerin taudin diagnoosi, jota ei ollut vahvistettu patologisilla tutkimuksilla.
14-3-3:a havaittiin 18:ssa 66:sta aivo-selkäydinnestenäytteestä (27 prosenttia), jotka olivat peräisin potilailta, joilla oli muitakin neurologisia sairauksia, joihin ei liittynyt dementiaa. Nämä 18 positiivista näytettä olivat peräisin potilailta, joilla oli akuutti virusenkefaliitti, aivohalvaus (ilman dementiaa) kuukauden sisällä ennen testausta, subaraknoidaalinen verenvuoto tai Rettin oireyhtymä. Creutzfeldt-Jakobin tautia ei voitu perustellusti sisällyttää minkään näistä häiriöistä erotusdiagnoosiin.
Kokonaisuudessaan 14-3-3-immunomäärityksen herkkyys Creutzfeldt-Jakobin taudin merkkiaineena oli 96 prosenttia (68 todellista positiivista tulosta jaettuna 71 todellisen positiivisen ja väärän negatiivisen tuloksen kesken; 95 prosentin luottamusväli 92-99 prosenttia) ja spesifisyys 88 prosenttia (164 todellista negatiivista tulosta jaettuna 186 todellisen negatiivisen ja väärän positiivisen tuloksen kesken; 95 prosentin luottamusväli 84 92 prosenttia). Vielä tärkeämpää on, että tämän määrityksen spesifisyys kaikkien dementiapotilaiden osalta oli 96 prosenttia (90 tosi negatiivista tulosta jaettuna 94 tosi negatiivisella ja väärällä positiivisella tuloksella; 95 prosentin luottamusväli 90-96 prosenttia), ja kun kolme potilasta, joilla oli dementia ja aivoinfarkti kuukauden sisällä ennen testausta, jätettiin testauksen ulkopuolelle, immunomäärityksen spesifisyys oli 99 prosenttia (90 tosi negatiivista tulosta jaettuna 91 tosi negatiivisella ja väärällä positiivisella tuloksella; 95 prosentin luottamusväli 97-100 prosenttia) (taulukot 1 ja 2).
Kaksiulotteisen elektroforeesin ja immunomäärityksen vertailu
TAULUKKO 3.
Taulukko 3. Proteiinien 130 ja 131 kaksiulotteisen elektroforeesin ja 14-3-3-immunomäärityksen vertailu.
Vertailimme proteiinien 130 ja 131 kaksiulotteista elektroforeesia ja 14-3-3-immunomääritystä 50 aivo-selkäydinnestenäytteessä (taulukko 3). Creutzfeldt-Jakobin tautia sairastavilta potilailta saaduista 15 näytteestä 13 oli positiivisia molemmilla testeillä, ja loput kaksi näytettä olivat negatiivisia proteiineille 130 ja 131 mutta positiivisia 14-3-3-proteiinille. Molempien testien tulokset olivat samat sellaisten potilaiden näytteissä, joilla oli dementia, johon ei liittynyt Creutzfeldt-Jakobin tautia tai muita neurologisia häiriöitä. Vaikka näiden kahden testin spesifisyydet ovat samankaltaiset, 14-3-3-immunomäärityksen herkkyys on hieman korkeampi.
14-3-3-immunomääritys eläimillä
Taulukko 4. Eläinten immunomääritys.
Taulukko 4. 14-3-3-immunomäärityksen tulokset eläimiltä otetuissa aivo-selkäydinnestenäytteissä.
Eläimillä tehtyjen tutkimusten tulokset vastasivat ihmisillä tehtyjen tutkimusten tuloksia. Kuvassa 2 esitetään määritystulokset aivo-selkäydinnesteestä, joka on saatu normaalista lehmästä (kaista 4) ja lehmästä, jolla on patologista näyttöä tarttuvasta spongiformisesta enkefalopatiasta (kaista 5). Kuten taulukosta 4 käy ilmi, 14-3-3-proteiinia havaittiin aivo-selkäydinnesteessä kuudessa naudassa yhdeksästä, joilla oli kokeellisesti aiheutettu tarttuva minkin enkefalopatia tai scrapie. Positiivinen testi oli myös yhdellä lehmällä, jolla oli kliinisiä oireita mutta ei patologista näyttöä tarttuvasta spongiformisesta enkefalopatiasta. Yhdelläkään vertailukarjalla ei ollut positiivisia testejä. Testi oli positiivinen viidellä lampaalla kuudesta lampaasta, joilla oli luonnollisesti hankittu scrapie, ja negatiivinen yhdellä vertailulampaalla. Kaikilla 15:llä kokeellisesti tartunnan saaneella simpanssilla testi oli positiivinen, kun taas yhdelläkään 77:stä kontrollisimpanssista ei ollut. 14-3-3-immunomäärityksen yleinen herkkyys eläimillä oli 87 prosenttia ja yleinen spesifisyys 99 prosenttia.