18O-leimaus: proteomiikan työkalu

Esitetään arviointi proteiinien proteolyyttisestä leimaamisesta ja kvantifioinnista diagnostisia tarkoituksia varten käyttämällä trypsiiniä ja 18O-rikastettua H2O:ta. Osoitamme, että vertaileva tai suhteellinen kvantifiointi voidaan suorittaa tehokkaasti tällä lähestymistavalla. Olemme kehittäneet protokollan, joka mahdollistaa leimattujen peptidien säilyttämisen luonnollisessa vedessä ilman pelkoa takaisinvaihdosta edellyttäen, että pH-arvo on riittävän alhainen trypsiinin katalyyttisen aktiivisuuden sammuttamiseksi, mutta ei niin alhainen, että se edistäisi kemiallista takaisinvaihtoa. Koska leimaustehokkuus riippuu peptidin luonteesta, ei ole olemassa yksinkertaista lineaarista suhdetta 16O/18O-digestipuskuriseoksen suhteellisen 16O/18O-puskuripitoisuuden (x) ja leimaustehokkuuden (y) välillä, vaan pikemminkin todennäköisyyteen perustuva suhde y = x(2). Näin ollen peptidin leimauksen laajuus käyttämällä 16O/18O-digestipuskuriseoksen suhteita voi poiketa merkittävästi lineaarisen suhteen perusteella odotetusta. Suhteellisen Ziptip-tehokkuuden arviointi osoitti näytteen talteenoton heikkenevän, kun peptidipitoisuutta pienennettiin normaaliolosuhteissa, mikä viittaa siihen, että on olemassa raja, jonka alapuolella tuotto vähenee. Lisäksi Speedvacin kuivumisen ja palautumisen aiheuttamat adsorptiohäviöt osoittivat vaatimattomia (20 %) häviöitä, jotka voivat vaihdella suuresti (0-50 %) eri peptidien välillä. Standardiproteiiniseosten liuoksessa tapahtuvan sulatuksen tehokkuus konsentraation funktiona osoitti lineaarista laskua konsentraation pienentyessä. Tämä on sopusoinnussa entsyymikineettisten vaikutusten kanssa ja korostaa mahdollista kvantitointivirhettä, joka voi syntyä arvioitaessa erilaista ilmentymistä peptidien havaitsemisen perusteella. Tutkimustemme tulokset osoittavat 18O-leimauksen voiman proteomiikan prosessien kehittämisen optimointivälineenä.