Kaikki denaturoidut ja natiivit BR:t voivat sitoutua GroEL:iin
Keskeinen osa GroEL:n toimintamekanismia on sen kyky tunnistaa moninaisia polypeptidejä pääasiassa substraatin hydrofobisten jäännösten ja GroEL:n apikaalisten domeenien heliksen H:n ja I:n välisten vuorovaikutussuhteiden välityksellä (kuvio 1 A) (Coyle et al. 1997). Tässä tutkimuksessa sekä denaturoidun että natiivin BR:n sitoutumista GroEL:iin tutkittiin ensin isotermisellä titrauskalorimetrialla (ITC), koska kummassakin tilassa on runsaasti hydrofobisia pintajäännöksiä, jotka ovat helposti GroEL:n saatavilla. Kuten kuvasta 2A käy ilmi, GroEL:n titraus BR:n kanssa tuottaa eksotermiset titraustermogrammit molemmissa tapauksissa. Lämpömuutokset johtuvat nimenomaan BR:n sitoutumisesta GroEL:iin, sillä BR:n peräkkäinen injektio määrityspuskureihin ilman kaperoniinia tuottaa tasaisia termogrammeja (täydentävä kuva S1). Kunkin kuvassa 2A esitetyn injektion lämpö integroitiin, korjattiin laimennuslämmöllä ja piirrettiin BR:n ja GroEL:n moolisuhdetta vastaan (kuva 2B). Lämmönmuutos sopii yhteen paikkasarjan sitoutumismalliin (punainen ja sininen käyrä), jolloin dissosiaatiovakio (Kd) on lähellä 0,3 nmol/l denaturoidulle BR:lle ja lähellä 6,0 nmol/l natiiville BR:lle (taulukko 1). Näin ollen BR:n denaturointi lisäsi GroEL:n sitoutumisaffiniteettia tähän kalvoproteiiniin yhden kertaluokan verran. Toisaalta kumman tahansa BR-näytteen sitoutumista ohjaa suotuisa entalpian muutos (ΔH) ja sitä vastaan negatiivinen entropian muutos (ΔS); molemmissa tapauksissa määritetty sitoutumisen stoikiometria (N) on lähellä ykköstä (taulukko 1). Natiivin BR:n sitoutuminen on kuitenkin selvästi vähemmän entalpista ja entropian kompensaatio on vähäisempää.
Kannenmuotoinen ko-kaperoniini GroES on olennainen komponentti GroEL:n välittämässä proteiinien taittumisessa bakteereissa, ja sen on osoitettu jakavan samat sitoutumiskohdat GroEL:ssä substraatin kanssa (Chen ja Sigler 1999). GroEL:n titraaminen denaturoidulla BR:llä GroES:n läsnä ollessa osoittaa, että GroES:llä on vain vähäinen vaikutus BR:n sitoutumiseen (täydentävä kuva S2 ja taulukko 1). Tämä tulos voidaan ymmärtää ottamalla huomioon Kd, joka GroEL/ES-kompleksin muodostumiselle määritettiin aiemmin 3 μmol/l ja joka on huomattavasti suurempi kuin tässä määritetty BR-GroEL-kompleksin Kd (Behlke ym. 1997). Tämä viittaa näiden kahden chaperoniiniproteiinin paljon heikompaan vuorovaikutukseen ja on siten yhdenmukainen merkityksettömän vaikutuksen kanssa. Kuitenkin ATP:n läsnä ollessa, joka säätelee GroEL:n ja GroES:n sitoutumis- ja vapautumisjaksoja in vivo, GroEL/ES:n affiniteetti kasvaisi kolme kertaluokkaa (normaalisti Kd ~1 nmol/L) (Farr ym. 2000), mikä teoreettisesti kykenisi kilpailemaan BR:n sitoutumisen kanssa GroEL:ään. Tämän jälkeen tutkittiin apoGroEL:n vaikutusta BR:n taittumiseen ja sen jälkeen GroES:n ja ATP:n roolia tässä prosessissa.
GroEL-GroES-järjestelmä voi moduloida BR:n taittumista DDM:n läsnäollessa
Osa SDS-denaturoidusta BR:stä havaittiin taittuvan uudelleen, kun sitä laimennettiin ylimäärällä liukoisuutta lisäävää detergenttiä n-dodekyyli-β-D-maltosidia (DDM), mikä kävi ilmi mittaamalla verkkokalvon absorptiokyvyn palautumista (lisäkuva S3) (Booth 1997). Merkittävää palautumista ei ollut havaittavissa määrityspuskurissa ilman detergenttiä tai pelkällä GroEL:llä täydennettynä. DDM:n läsnä ollessa GroEL:n lisäyksellä oli kuitenkin selvä vaikutus BR:n taittumiseen (täydentävä kuva S3). GroEL:n (0,15 μmol/l) välittämän taittumisen nopeusvakio, joka arvioitiin sovittamalla yhden eksponentiaalisen kinetiikan avulla, arvioitiin olevan ~kaksi kertaa pienempi kuin spontaani taittuminen. GroEL:n tiedetään tyypillisesti hidastavan sellaisten liukoisten proteiinien taittumista, jotka voivat taittua tehokkaasti sen puuttuessa. Tämä on selitetty kilpailulla molekyylinsisäisen taittumisen ja molekyylien välisen GroELiin sitoutumisen välillä (Gray ja Fersht 1993; Itzhaki ym. 1995). Vaikuttaa täysin uskottavalta, että GroEL käyttäytyy samalla tavalla denaturoituneen BR:n uudelleenfoldauksessa. Kun GroEL:n konsentraatio nostettiin 0,30 μmol/L:iin, arvioitu nopeusvakio ei muuttunut selvästi, kun taas taittumisen tuotto saavutti paljon suuremman tason kuin spontaani taittuminen 60 minuutin kuluttua (täydentävä kuva S3). Nämä tiedot osoittavat, että apoGroEL voi vähentää BR-taittumisnopeutta, mutta parantaa taitetun proteiinin saantoa.
Koska bakteerisolut sisältävät useita millimolaareja ATP:tä ja normaaliolosuhteissa GroES:n ja GroEL:n suhteellinen moolisuhde on 1,9 ja lämpöshokin jälkeen 4,7 (Moparthi ym. 2013); GroEL tuskin pysyy pitkään sitomatta ATP:tä ja GroES:ää. ATP:n läsnä ollessa (sininen kuvassa 3A) oikein taitetun BR:n palautuminen oli huomattavasti nopeampaa ja suurempaa verrattuna pelkkään apoGroELiin tai spontaaniin prosessiin (punainen ja musta kuvassa 3A). Sitä vastoin GroEL:n ja GroES:n yhdistelmällä ei ollut juurikaan vaikutusta spontaanin taittumisen nopeuteen, mutta se vähensi saantoa jonkin verran (kuva 3A, syaani). Tämä viittaa GroEL:n ja GroES:n väliseen vuorovaikutukseen, joka ei vaadi ATP:tä ja jonka todennäköisesti indusoi GroEL:ään sitoutunut BR, mikä puolestaan vaikutti haitallisesti oikein taitetun proteiinin palautumiseen. Kun käytettiin täydellistä chaperoniinijärjestelmää (kuva 3A, vihreä), havaittiin maksimaalinen nopeuden lisääntyminen, mutta taittumisen saanto jäi kahden edellisen tapauksen väliin.
Yllä olevat tulokset osoittavat, että ATP ja GroES voivat vaikuttaa GroEL-välitteiseen BR:n taittumiseen eri tavoin. GroES:n sitoutuminen GroEL:iin on jossain määrin haitallista taittumiselle, toisin kuin tunnetusti substraatin kapseloitumisella GroEL/ES-häkkiin on positiivinen rooli avustetun taittumisen kannalta (Jewett ja Shea 2010). Seuraavaksi kysyimme, miten tämä haitallinen vaikutus syntyy. Kiehtovasti GroES yksinään tai sen liikkuva silmukkasekvenssi, jonka kautta GroES sitoutuu GroEL:iin, helpotti myös taittuneen BR:n palautumista (täydentävä kuva S4). Lisäksi silmukkasekvenssillä oli samanlainen vaikutus kuin GroES:llä GroEL:n välittämässä taittumisessa ATP:n puuttuessa ja läsnä ollessa (täydentävä kuva S4). Tosin se ei pysty GroES:n tavoin muodostamaan suljettua korkkia GroEL:n keskusontelon yläpuolelle, mikä viittaa silmukan ja GroEL:n vuorovaikutuksen merkittävään osuuteen taittumisessa. Huomattavaa on, että GroEL:n apikaalisen pinnan hydrofobiset jäännökset, jotka osallistuvat GroES:n liikkuvan silmukan sitomiseen, ovat enimmäkseen päällekkäisiä substraattiproteiinin sitomiseen osallistuvien jäännösten kanssa (Motojima ym. 2000). On epätodennäköistä, että hydrofobinen BR syrjäytyi ja vapautui hydrofiiliseen GroEL/ES-häkkiin liikkuvan silmukan avulla, varsinkin kun otetaan huomioon DDM-mikellien läsnäolo häkin ulkopuolella, mikä edistäisi entisestään BR:n taittumista tai liukenemista. Mieluiten, kuten on osoitettu useiden liukoisten proteiinien avustetun taittumisen yhteydessä (Motojima ja Yoshida 2010), BR voidaan vangita lähelle GroEL/ES-rajapintaa, joka työntyy osittain ulospäin, kun tässä tutkimuksessa käytettiin koko järjestelmää tai jopa pelkkää GroEL/ES:ää. Tällainen vuorovaikutus saattaa estää BR:n pääsyn suotuisille DDM-mikelleille, mikä johtaa sekä GroES:llä että sen liikkuvalla silmukalla havaittuun alentuneeseen taittotuotokseen.
Joidenkin tutkimusten mukaan ATP:n ja GroES:n tehtävänä on kuitenkin vain dissosioida tahmeat substraatit (eli joiden Kd-arvo on tässä määritetyllä nmol/L-alueella), jotka rajoittavat avustettua taittumisnopeutta tai jopa estävät GroEL:n taittumisaktiivisuuden, jos niitä ei ole poistettu pois päältä (Priya ym. 2013). Testataksemme, onko GroES:llä ja ATP:llä samanlainen vaikutus avustetussa BR:n taittumisessa, inkuboimme ensin apoGroEL:ää denaturoidun BR:n kanssa 60 minuutin ajan; sitten lisäsimme GroEL:ää tai/ja ATP:tä (Kuva 3B). Jommankumman komponentin myöhempi lisääminen edisti edelleen BR:n taittumista, mutta oli vähemmän tehokasta kuin molempien samanaikainen lisääminen, mikä osoittaa näiden kahden komponentin synergismiä GroEL-välitteisen taittumisen auttamisessa. Anisotrooppisuusmittaukset BR:n transmembraanipeptideillä, joita käytettiin denaturoidun BR:n mimeetteinä denaturoidun BR:n dynaamisen luonteen ja GroEL:n ja BR:n välisten vuorovaikutusten aiheuttamien hankaluuksien välttämiseksi, osoittivat, että vain ATP:n ja GroES:n yhdistelmä kykeni erottamaan tehokkaasti valmiiksi muodostuneen peptidi-GroEL-kompleksin toisistaan (täydentävä kuva S5). Näyttää siis siltä, että sekä GroES että ATP ovat välttämättömiä korkea-affiniteettisten BR-konformerien dissosioimiseksi ja pysähtyneiden GroEL:n sitoutumis- (tai katalyyttisten) paikkojen elvyttämiseksi.
Tarkistaaksemme tarkemmin GroES:n ja ATP:n vaikutusta GroEL:n välittämään BR:n taittumiseen käytimme yksirenkaista GroEL-mutanttia (SR1), joka muodostaa vakaan kompleksin GroES:n kanssa (Weissman ym. 1995), toisin kuin syklisesti kiertävä GroEL-GroES-järjestelmä. Samoin kuin GroEL:llä tekemämme havainto, ATP lisäsi SR1:n välittämän taittumisen nopeutta ja saantoa (sininen kuvassa 3C), kun taas GroES:n läsnäolo vähensi molempia näkökohtia huomattavasti (syaani) verrattuna tapaukseen, jossa käytettiin pelkkää apoSR1:tä tai spontaania prosessia (punainen tai musta). Koska denaturoidun BR:n todettiin ITC:n avulla sitoutuvan SR1:een stoikiometrialla, joka oli lähellä ykköstä (täydentävä kuva S2), ja käytetyn SR1:n konsentraatio oli kaksi kertaa suurempi kuin GroEL:n konsentraatio, spekuloimme, että BR-SR1-komplekseja muodostui enemmän kuin BR-GroEL-komplekseja, jolloin GroES:llä oli suurempi vaikutus taittumiseen (syaani). Odotetusti sekä ATP:n että GroES:n lisäyksellä oli merkityksetön vaikutus BR:n palautumiseen (vihreä), mikä johtuu GroES:n palautumattomasta sitoutumisesta SR1:een ATP:n läsnä ollessa (Weissman ym. 1995). Lisäksi tämä tulos osoittaa, että GroEL:n kanssa havaittu suurin nopeuden lisäys johtuu ATP:n säätelemistä GroES:n sitoutumisen ja vapautumisen moninkertaisista sykleistä.
GroEL:llä yksinään tai yhdessä ATP:n tai/ja GroES:n kanssa oli vähäinen vaikutus DDM:llä liuotetun natiivin BR:n rakenteeseen (kuva 3D), mikä viittaa vahvempaan molekyylinsisäiseen vuorovaikutukseen natiivin proteiinin sisällä kuin molekyylien väliseen sitoutumiseen GroEL:ään. Näin ollen BR:n kaperoniinivälitteinen siirtyminen metastabiilista denaturoituneesta tilasta natiiviin tilaan on termodynaamisesti suotuisa.
Todisteet sekä kaperoniinivälitteisestä hajoamisesta että taittumisesta
Mittaamalla BR:n spontaania taittumista vaihtelevilla pitoisuuksilla osoitetaan, että aggregaatio johti vain osittaiseen oikealla tavalla taittuneen BR:n elpymiseen ja näennäinen vauhti oli konsentraatiosta riippumaton, mikä viittaa siihen, että aggregaatio oli peruuttamatonta (lisäkuva S6). Ilman solubilisoivaa detergenttiä DDM:ää SDS-denaturoidun BR:n diffuusiokertoimen (~67 μm2/s) arvioitiin fluoresenssikorrelaatiospektroskopian (FCS) avulla olevan paljon pienempi kuin GroEL:iin sitoutuneen BR:n (~104 μm2/s) (kuva 4). Tämä kuvastaa sitä, että denaturoidun BR:n muodostamat aggregaatit ovat jopa suurempia kuin BR-GroEL-kompleksi, jonka sitoutumisen stoikiometria on lähellä ykköstä, kuten ITC:llä määritettiin. Tämä tarkoittaa myös sitä, että GroEL pystyi häiritsemään aggregaatiorakennetta, mikä olennaisesti pumppaa tuottavaa taittumisreittiä monomeerisen BR:n kanssa. Lisäksi DDM:llä liuotetun nBR:n diffuusiokertoimeksi määritettiin ~117 μm2/s, mikä on suurempi kuin dBR:n ja GroEL:n välinen diffuusiokerroin ja paljon suurempi kuin pelkän dBR:n (kuva 4). Tämä viittaa siihen, että nBR oli hyvin dispergoitunut DDM:n läsnä ollessa, ja tukee myös ajatusta GroEL:n välittämästä dBR:n disaggregoitumisesta. Sitä paitsi, kun denaturoituun BR:ään lisättiin täydellinen chaperoniinijärjestelmä, valkoisia flokkuloituneita saostumia näkyi välittömästi (tietoja ei ole esitetty), mikä viittaa pakotettuun purkautumiseen sekä GroES:n ja ATP:n väliseen synergismiin tässä suhteessa. Ilman solubilisoivia detergenttejä tai lipidejä, jotka jäljittelevät biologisia kalvoja bulkkiliuoksessa, taittumaton BR aggregoituisi ja saostuisi välittömästi, toisin kuin DDM:n läsnäollessa havaittu merkittävä taittumisnopeuden lisäys.