BRAF in Melanoma: ESMO Biomarker Factsheet

BRAAF:n määritelmä

BRAF (v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1) on seriini/treoniiniproteiinikinaasi, jolla on kriittinen rooli RAS-RAF-MEK-ERK mitogeeni aktivoituneen proteiinikinaasin (MAPK) solun signalointireitillä. Tämän reitin aktivoituminen siirtää solunulkoisia signaaleja solun läpi fosforylaatiotapahtumien kaskadin kautta, mikä johtaa muuttuneeseen geeniekspressioon, solujen kasvuun, eloonjäämiseen ja erilaistumiseen normaaleissa ja muuntuneissa soluissa.

BRAF on voimakas onkogeeni, joka aktivoituu noin 8 prosentissa kaikista syövistä. BRAF-pistemutaatioita on havaittu monissa kiinteissä kasvaimissa ja osassa hematologisia pahanlaatuisia kasvaimia, ja ne ovat erityisen yleisiä melanoomissa . Suurin osa BRAF-mutaatioista esiintyy kinaasin aktivointialueella, mikä johtaa BRAF:n konstitutiiviseen aktivoitumiseen ja MEK:n fosforylaatioon riippumatta reseptorityrosiinikinaasien tai RAS:n aiheuttamasta aktivoitumisesta. Tämä synnyttää ERK:n vastuksettoman, konstitutiivisen aktivaation, joka johtaa solukasvun edistämiseen ja apoptoosin välttämiseen ja lopulta neoplastiseen transformaatioon. Yleisin BRAF-mutaatio, jota esiintyy yli 90 prosentissa BRAF-mutaation omaavista kasvaimista, on kinaasin aktivaatiodomeenin aminohapossa 600 (V600E) oleva valiinin korvaaminen glutamiinihapolla. Tämä substituutio jäljittelee aktivointisilmukan fosforylaatiota, mikä saa aikaan konstitutiivisen BRAF-proteiinikinaasiaktiivisuuden.

BRAF-mutaatiot melanoomassa

Aktivoituvia BRAF-mutaatioita esiintyy noin 50 prosentissa kaikista melanoomista. Noin 90 % näistä mutaatioista esiintyy aminohapon 600 kohdalla, joista suurin osa on BRAF V600E -mutaatioita . Muitakin mutaatioita on todettu kodonilla 600, mukaan lukien BRAF V600K, V600D ja V600M.

BRAF-mutaatioiden suuri esiintymistiheys melanoomissa merkitsee, että tämä onkogeeni voi olla houkutteleva terapeuttinen kohde, ja se on johtanut pitkälle edenneen melanooman kohdennetun hoidon uuteen aikakauteen.

BRAF prognostisena biomarkkerina melanoomassa

Potilaiden, joilla oli BRAF-mutaatioita sisältävä melanooma, ennuste oli ennen BRAF-inhibiittoreiden hyväksymistä huonompi kuin niiden potilaiden, joiden tauti ilmentää villityyppistä BRAFia. Useissa tutkimuksissa on osoitettu metastaattista melanoomaa sairastavilla potilailla yhteys BRAF-mutaation esiintymisen ja huonomman ennusteen välillä ensimmäisen etäpesäkkeen diagnosoinnista tai etäpesäkkeen resektiosta. BRAF-mutaation esiintymisellä ei kuitenkaan näytä olevan vaikutusta taudista vapaaseen aikaan ensimmäisen melanooman diagnosoinnista ensimmäiseen etämetastaasiin . BRAF-positiivista melanoomaa sairastavat potilaat ovat yleensä nuorempia ja heidän elossaolonsa on huonompi kuin villiä melanoomaa sairastavien potilaiden diagnoosihetkellä. Vaikka metastaattisen taudin erityisiä kliinisiä piirteitä ei ole vielä korreloitu BRAF-mutaatiotilanteen kanssa, BRAF-mutaatioiden primaariseen melanoomaan on liitetty erityisiä kliinispatologisia piirteitä, kuten sijainti (runko), varhaisempi puhkeamisikä ja ympäröivän ihon kroonisten aurinkovaurioiden puuttuminen .

BRAF ennakoivana biomarkkerina melanoomassa

BRAF-kohdennetut hoidot osoittavat huomattavaa tehoa BRAF-mutaatiomelanoomissa, ja BRAF V600 -mutaation esiintyminen toimii vasteen ennakoivana biomarkkerina. Kaksi BRAF:n estäjää, vemurafenibi ja dabrafenibi, ja yksi MEK:n estäjä, trametinibi, on hyväksytty Euroopassa sellaisten aikuispotilaiden hoitoon, joilla on leikkaamaton tai metastaattinen melanooma, jossa on BRAF V600 -mutaatio. BRAF-mutaatiota sairastavien melanoomapotilaiden hoito näillä kohdennetuilla hoidoilla on muuttanut tähän molekyylimuutokseen liittyvää huonoa ennustetta. Näillä potilailla on nyt pidempi mediaanielinaika kuin potilailla, joilla on villityyppinen BRAF-melanooma.

BRAF:n estäjät vemurafenibi ja dabrafenibi sitoutuvat spesifisesti BRAF:n aktiivisuuteen ja tukahduttavat BRAF:n aktiivisuutta ja alempana olevaa signalointia BRAF V600 -mutaatiota sisältävissä soluissa. Kliinisissä tutkimuksissa kumpikin näistä yhdisteistä on osoittanut syvällisiä kliinisiä vasteita potilailla, joilla on BRAF V600 -mutaatioita sisältävä melanooma, ja ne ovat lisänneet merkittävästi etenemisvapaata elossaoloaikaa ja kokonaiselossaoloaikaa verrattuna tavanomaiseen solunsalpaajahoitoon .

MEK-inhibiittori trametinibi sitoutuu fosforyloimattomaan MEK:iin estäen RAF-riippuvaisen MEK:n fosforylaation ja aktivoitumisen. Kliinisissä tutkimuksissa trametinibi paransi etenemisvapaata ja kokonaiselossaoloaikaa tavanomaiseen kemoterapiaan verrattuna, vaikka saavutettu kokonaisvaste ei ollut yhtä korkea kuin vemurafenibilla tai dabrafenibillä . Näyttö viittaa siihen, että trametinibillä ei ole kliinistä tehoa potilailla, jotka ovat edenneet aiemmalla BRAF:n estäjähoidolla, mutta viimeaikaiset kliiniset tutkimustulokset osoittavat, että dabrafenibin ja trametinibin yhdistelmähoito parantaa tehoa ilman, että haittavaikutukset pahenevat, verrattuna kumpaankaan aineeseen yksinään . FDA on hyväksynyt tämän yhdistelmän sellaisten melanoomapotilaiden hoitoon, joilla on BRAF V600 -mutaatioita.

Näiden kohdennettujen hoitojen menestys BRAF-mutaatiota sairastavien melanoomapotilaiden hoidossa on johtanut suositukseen, jonka mukaan potilaille, joilla on metastasoitunut tai leikkauskelvoton melanooma, olisi tehtävä BRAF V600 -mutaatioiden seulontatutkimus joko etäpesäkkeestä (mieluiten) tai primaarisesta kasvaimesta, jotta voidaan auttaa ohjaamaan terapeuttista päätöksentekoa .

Resistenssi BRAF:n estolle

Pieni osajoukko potilaista, joilla on BRAF-mutaatioita sisältävä melanooma, ei reagoi BRAF- tai MEK-inhibiittorihoitoon luontaisten resistenssimekanismien vuoksi, ja useimmille potilaille, jotka aluksi reagoivat näihin hoitoihin, kehittyy lopulta hankitun resistenssin mekanismi, joka johtaa taudin etenemiseen. Mahdollisia resistenssimekanismeja on useita, ja useimpiin tähän mennessä kuvattuihin mekanismeihin liittyy MAPK-reitin uudelleenaktivoituminen. NRAS-mutaatiot ja BRAF V600E -mRNA:n splice-variantit ovat yleisiä tähän mennessä tunnistettuja mekanismeja . PI3K-PTEN-AKT-reitin aktivoitumisella on myös osoitettu olevan merkitystä BRAF:n estäjiin kohdistuvassa hankitussa resistenssissä.

Prekliinisessä ja kliinisessä kehitystyössä on tällä hetkellä useita RAF:n estäjiä, joilla kullakin on erilaiset ominaisuudet, joilla pyritään voittamaan resistenssimekanismit, jotka voivat rajoittaa näiden lääkkeiden tehoa.

BRAF-testaussuositukset melanoomassa

Vemurafenibi, dabrafenibi ja trametinibi on tarkoitettu potilaille, joilla on leikkauskelvoton tai metastaattinen melanooma ja joilla on BRAF V600 -mutaatiopositiivinen kasvain, joka on varmistettu validoidulla testillä, joka on suoritettu akkreditoidussa (sertifioidussa) laitoksessa, joka sisältää asianmukaiset laatukontrollit .

BRAF V600 -mutaatioiden havaitsemiseen on käytettävissä useita menetelmiä, kuten mutaatiospesifinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (RT-PCR), Sangerin sekvensointi, pyrosekvensointi, konformaatioanalyysi ja korkean resoluution sulamisanalyysi.

Vemurafenibin ja dabrafenibin rinnalle kehitettiin kaksi RT-PCR-seurantadiagnostiikkamääritystä, joiden avulla arvioitiin potilaiden kelpoisuutta osallistua kliinisiin tutkimuksiin; cobas® 4800 BRAF V600 -mutaatiotesti (cobas® 4800 BRAF V600 Mutation Test ) ja bioMerieuxin (bMx) THxID®-BRAF-määritys (bioMerieux (bMx) THxID®-BRAF assay , vastaavasti. Molemmilla testeillä on FDA:n ja CE-IVD:n hyväksyntä BRAF-mutaatioiden havaitsemiseen, ja ne sisältävät genomisen DNA:n uuttamisen formaliiniin kiinnitetystä, parafiiniin sulautetusta (FFPE) kasvainnäytteestä ja RT-PCR-määrityksen, jolla havaitaan sekä villityyppinen että mutantti BRAF. cobas® 4800 -testi on suunniteltu havaitsemaan vallitseva BRAF V600E -mutaatio suurella herkkyydellä (jopa 5 % V600E-sekvenssiä FFPE-peräisestä DNA:sta saadun villityyppisen sekvenssin taustalla), ja se havaitsee myös harvinaisemmat BRAF V600D- ja V600K-mutaatiot pienemmällä herkkyydellä. THxID®-BRAF-määritys on suunniteltu havaitsemaan BRAF V600E- ja V600K-mutaatiot suurella herkkyydellä (jopa 5 % V600E- ja V600K-sekvenssiä villin tyypin sekvenssin taustalla FFPE-kudoksesta uutetulla DNA:lla) ja havaitsee myös harvinaisemmat BRAF V600D -mutaation ja V600E/K601E-mutaation alhaisemmalla herkkyydellä . Euroopassa on kuitenkin saatavilla useita erilaisia CE-IVD-menetelmiä BRAF-testausta varten.

Laadukkaiden ja oikea-aikaisten BRAF-mutaatiotestaustulosten varmistaminen

On tärkeää, että kaikkien BRAF-inhibiittorihoitoihin soveltuvien melanoomapotilaiden BRAF-mutaatio tutkitaan täsmällisesti, luotettavasti ja oikea-aikaisesti, jotta tuloksia voidaan soveltaa asianmukaisesti potilaan kliiniseen hoitoon.

BRAAF-mutaatiotulosten saatavuuteen kliinisille lääkäreille voivat vaikuttaa:

• se, missä vaiheessa potilaan hoitopolkua testiä pyydetään,
• BRAF-mutaatiotestiin valittujen potilaiden vaihe ja kliininen kiireellisyys,
• itse BRAF-mutaatiotestin läpimenoaika,
• ja se,
• ja se,
• millä tavalla tulokset välitetään hoitaville kliinikoille .

Mitä tekniikkaa ja mitä algoritmia tulisi käyttää melanooman BRAF-statuksen analysoinnissa?

Kaikilla BRAF-mutaatioiden havaitsemisessa käytetyillä menetelmillä on etunsa ja haittansa, ja valinta yhden käyttämiseksi toisen sijasta perustuu tavallisesti nykyisiin paikallisiin käytäntöihin ja kokemukseen eri kliinisissä laboratorioissa .

Parametreja, jotka olisi otettava huomioon sopivaa liitännäisdiagnostiikkatestiä valittaessa, ovat herkkyys, spesifisyys, analyyttisen herkkyyden raja ja epäonnistumisasteet .

Menetelmiä herkkyyden ja spesifisyyden lisäämiseksi ja epäonnistumisprosenttien pienentämiseksi ovat mm :

• valitun menetelmän perusteellinen validointi vertailemalla sitä ”gold-standard” -menetelmiin,
• näytteiden makrodissektioiden suorittaminen tekniikan herkkyyden lisäämiseksi,
• pienten amplikonien valitseminen PCR-monistusta varten DNA:n hajoamisesta johtuvan epäonnistumisprosentin pienentämiseksi
• menetelmän jatkuva validointi soveltamalla parhaita toimintatapoja ja osallistumalla ulkoiseen laadunvalvontaan .

Potilasvalinta

Vemurafenibin, dabrafenibin ja trametinibin eurooppalaisen myyntiluvan mukaisesti BRAF-mutaation testausta suositellaan potilaille, joilla on diagnosoitu leikkaamaton tai metastaattinen melanooma. Eurooppalaisissa ohjeissa todetaan, että BRAF-mutaatiotestausta ei suositella primaarikasvaimissa potilailla, joilla ei ole etäpesäkkeitä.

Key References

1. Holderfield M, Deuker MM, McCormick F, et al. Targeting RAF kinases for cancer therapy: BRAF-mutaatiomelanooma and beyond. Nature Reviews Cancer 2014;14:455-67.
2. Davies H, Bignell GR, Cox C, et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature 2002;417: 949-54.
3. Gonzalez D, Fearfield L, Nathan P, et al. BRAF mutation testing algorithm for vemurafenib treatment in melanoma: recommendations from an expert panel. Br J Dermatol 2013;168:700-7.
4. Long GV, Menzies AM, Nagrial AM, et al. Prognostic and clinicopathologic associations of oncogenic BRAF in metastatic melanoma. J Clin Oncol 2011;29:1239-46.
5. Vemurafenibi. Valmisteyhteenveto. 2014.
6. Dabrafenibi. Valmisteyhteenveto. 2015.
7. Trametinibi. Valmisteyhteenveto. 2015.
8. Chapman PB, Hauschild A, Robert C, et al. Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation. N Engl J Med 2011;364:2507-16.
9. Hauschild A, Grob JJ, Demidov LV, et al. Dabrafenib in BRAF-mutated metastatic melanoma: a multicentre, open-label, phase 3 randomised controlled trial. Lancet 2012;380:358-65.
10. Flaherty KT, Robert C, Hersey P, et al. Improved survival with MEK inhibition in BRAF-mutated melanoma.N Engl J Med2012;367:107-14.
11. Flaherty KT, Infante JR, Daud A, et al. Combined BRAF and MEK inhibition in melanoma with BRAF V600 mutations. N Engl J Med 2012;367:1694-703.
12. Dummer R, Hauschild A, Guggenheim M, et al. ESMO Guidelines Working Group. Cutaneous melanoma: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol 2012;23(Suppl 7):vii86-91.
13. Chapman PB. Mechanisms of resistance to RAF inhibition in melanomas harboring a BRAF mutation Am Soc Clin Oncol Educ Book 2013; doi: 10.1200/EdBook_AM.2013.33.e80.
14. Shi H, Hugo W, Kong X, et al. Acquired resistenssi ja klonaalinen evoluutio melanoomassa BRAF inhibiittorihoidon aikana. Cancer Discov 2014;4(1):80-93. doi: 10.1158/2159-8290.CD-13-0642. Epub 2013 Nov 21.

.