Escher-FBA:n käytön havainnollistamiseksi todellisissa sovelluksissa esittelemme neljä keskeistä FBA-esimerkkiä, jotka voidaan suorittaa suoraan selaimessa. Ne on mukautettu FBA:ta ja sen sovelluksia koskevasta katsauksesta . Nämä esimerkit perustuvat E. colin oletusarvoiseen ydinmalliin, joten ne ovat valmiita toteutettaviksi heti, kun Escher-FBA-verkkosivu avataan. Muista napsauttaa Reset Map -painiketta kunkin esimerkin välissä. Jos sinulla on vaikeuksia reaktion löytämisessä, napsauta Näytä-valikon Etsi-vaihtoehtoa (tai näppäimistön f-näppäintä) avataksesi hakupalkin.
FBA vaihtoehtoisilla hiilisubstraateilla
Ensimmäinen esimerkki havainnollistaa FBA:n käyttöä sen ennustamiseen, voiko kasvua tapahtua vaihtoehtoisilla hiilisubstraateilla. E. colin oletusarvoinen ydinmalli sisältää simuloidun minimaalisen väliaineen, jossa hiililähteenä on D-glukoosi. Tässä vaihdetaan hiililähde D-glukoosista sukkinaattiin. Siirry ensin hiirellä sukkinaatin vaihtoreaktion EX_succ_e päälle ja muuta alarajaksi – 10 mmol/gDW/h joko vetämällä liukusäädintä tai syöttämällä – 10 Lower Bound -kenttään. Siirry seuraavaksi hiirellä D-glukoosin vaihtoreaktion EX_glc_e päälle ja joko nosta alaraja arvoon 0 tai napsauta Knockout-painiketta. Oletustavoitteena on edelleen kasvun maksimointi, joten nämä kaksi muutosta ohjaavat ohjelmaa laskemaan maksimikasvunopeuden, kun hiililähteenä käytetään sukkinaattia D-glukoosin sijasta. Sinun pitäisi nähdä, että ennustettu maksimikasvunopeus laskee 0,874 h- 1:stä 0,398 h- 1:een, mikä heijastaa E. colin alhaisempaa kasvua sukkinaatilla (kuva 2a). Tämä on yleinen lähestymistapa muutosten tekemiseen Escher-FBA:ssa; mene hiirellä reaktion päälle, tee tarvittavat muutokset, ja Escher-FBA näyttää tulokset automaattisesti. Hiililähteen vaihdon alarajan arvot edustavat kokeellisia mittauksia, joten voit kokeilla säätää tietyn alarajan arvoa realistisiin arvoihin kasvulle muilla hiililähteillä.
Esimerkkejä Escher-FBA:n simulaatioista. (a) Simuloitu kasvu, jossa ainoana hiililähteenä on sukkinaatti. (b) Simuloitu anaerobinen kasvu glukoosin minimialustalla. (c) ATP-tuoton maksimointi oletusmallissa. (d) S. cerevisiaen iMM904-mallin kasvu. Huomaa, että nuolien leveyttä kasvatettiin asetusvalikossa, jotta muutokset olisivat selvemmin havaittavissa
FBA anaerobisen kasvun aikana
Anaerobista kasvua voidaan simuloida samalla tavalla viemällä hiiren kursori EX_o2_e-reaktion päälle ja joko napsauttamalla painiketta Knockout (tyrmääminen) tai muuttamalla alempi raja-arvo arvoon 0. Jos muutat hapenvaihdon nollaan, kun suksinaatti on edelleen ainoa hiililähde, Flux Through Objective -ilmaisin näyttää ”Infeasible solution/Dead cell”, mikä tarkoittaa, että kasvu ei ole mahdollista. Kokeile klikata oikeassa alakulmassa olevaa Reset-painiketta simuloidaksesi minimaalista väliaineen, jossa hiililähteenä on D-glukoosi, ja tyrmää sitten EX_o2_e, jolloin ennustetun kasvunopeuden pitäisi olla 0,211 h- 1 (kuva 2b).
FBA yhdistelmätavoitteilla
Escher-FBA tukee useiden tavoitteiden asettamista Yhdistelmätavoitteet-tilassa. Oletusmallissa uuden tavoitteen asettaminen poistaa aina edellisen tavoitteen käytöstä. Ota tila käyttöön napsauttamalla ensin näytön alareunassa olevaa Compound Objectives (Yhdistetyt tavoitteet) -painiketta. Esimerkki tilan käytöstä: Jos haluat tarkistaa maksimaalisen kasvunopeuden ja minimoida SUCDi:n kautta kulkevan virtauksen, aloita oletustavoitteella, joka on biomassan tuotannon maksimointi. Vie sitten hiiri SUCDi:n reaktiomerkinnän päälle ja napsauta työkaluvihjeessä olevaa Minimize-painiketta. Oikeassa alareunassa pitäisi näkyä molemmat tavoitteet lueteltuina. Huomaa, että tällä hetkellä tuetaan vain tavoitekertoimia 1 tai – 1 (joita edustavat Maximize ja Minimize). Jos haluat palata yksittäisiin tavoitteisiin, napsauta uudelleen Yhdisteen tavoitteet -painiketta.
Aineenvaihdunnan tuottojen analysointi
Voidaan myös käyttää Escher-FBA:ta esiasteiden ja kofaktoreiden, kuten ATP:n, maksimaalisten tuottojen määrittämiseen. Tarvitaan vain stoikiometrisesti tasapainossa oleva reaktio, joka kuluttaa kiinnostavan kofaktorin. ATP:n ylläpitoreaktio (ATPM) on yksi tällainen esimerkki. ATP:n maksimaalisen tuotannon määrittäminen edellyttää, että viet hiiren ATPM-reaktion päälle ja napsautat Maximize-painiketta. Tavoitteen asettaminen tällä tavalla toimii, koska jotta järjestelmä voisi maksimoida ATPM-reaktion kautta kulkevan virtauksen, sen on ensin tuotettava ATP:tä mahdollisimman paljon. Kun ATPM maksimoidaan E. colin oletusarvoisessa ydinmetaboliamallissa, tavoitearvo on 175 mmol/gDW/h. (Kuva 2c). Kun hiililähteenä on sukkinaatti, tämä arvo laskee 82,5 mmol/gDW/h. Kun hiililähteenä on sukkinaatti, tämä arvo laskee 82,5 mmol/gDW/h. Samaa menettelyä voidaan noudattaa minkä tahansa kiinnostavan aineenvaihduntatuotteen kohdalla luomalla stoikiometrisesti tasapainoinen kulutusreaktio ja asettamalla malli maksimoimaan kyseisen reaktion läpi kulkeva virta. Huomaa, että tällä hetkellä ei ole mahdollista luoda tällaista reaktiota automaattisesti Escher-FBA:ssa, mutta tämä voidaan lisätä tulevaan versioon.
Virran vaihteluanalyysi
Vaihtoehtoisten optimaalisten ratkaisujen analysointi aineenvaihdunnassa on toinen hyödyllinen FBA:n sovellus. Koska FBA:n avulla tuotetut ratkaisut eivät useinkaan ole ainutkertaisia, voi olla hyödyllistä tietää, minkälainen vaihteluväli vuon arvoilla tietty reaktio voi olla. Vuotovaihteluanalyysia (FVA) käytetään usein näiden vaihteluvälien laskemiseen koko verkostossa. Escher-FBA ei tue suoraan FVA-laskelmia, mutta ne on mahdollista laskea tietylle reaktiolle. Tätä varten mene ensin hiirellä kohdefunktion (biomassareaktio Biomass_Ecoli_core_w_GAM) päälle ja aseta ylä- ja alarajat hieman nykyistä vuon arvoa pienemmiksi (oletuskartassa kokeile 0,870). Siirry seuraavaksi hiirellä kiinnostavan reaktion päälle ja napsauta Maximize- ja Minimize-painikkeita nähdäksesi kyseisen reaktion läpi kulkevan maksimi- ja minimivirran optimaalisen kasvunopeuden vallitessa. Esimerkiksi maksimoimalla ja minimoimalla glykolyysin GAPD:n kautta kulkeva vuo saadaan toteutuva vuoalue 15,44-16,68 mmol/gDW/h, mikä osoittaa, että glykolyyttinen vuo on erittäin rajoitettu suurilla kasvunopeuksilla. Toisaalta maksimoimalla ja minimoimalla MALS:n kautta kulkevaa virtausta glyoksylaattivirtauksessa saadaan toteuttamiskelpoinen virtauksen vaihteluväli 0-2,64 mmol/gDW/h, mikä osoittaa, että glyoksylaattivirtausvirtaus voi olla aktivoitunut tai inaktiivinen suurilla kasvunopeuksilla. Tämä menettely voidaan tehdä mille tahansa reaktiojoukolle, ja käyttäjä voi rajoittaa järjestelmänsä mille tahansa määrälle vuon arvoja nähdäkseen tietylle reaktiolle käytettävissä olevien ratkaisujen vaihteluvälin.
Muiden genomin mittakaavan mallien käyttäminen
E. coli -ydinmallin oletusmalli ei ole ainoa simuloitavissa oleva järjestelmä. Jos esimerkiksi halutaan suorittaa simulaatioita hiivasolulla, Saccharomyces cerevisiaen malli ja kartta voidaan ladata osoitteesta http://bigg.ucsd.edu/models/iMM904. Napsauta kyseisellä sivulla mallin (iMM904.json) ja kartan (iMM904.Central carbon metabolism.json) latauspainiketta. Lataa nämä Escher-FBA:ssa napsauttamalla Load Map JSON (Lataa kartta JSON) Kartta-valikossa ja Load Model JSON (Lataa malli JSON) Malli-valikossa molempien JSON-tiedostojen lataamiseksi. Kun kartta on ladattu, se on valmis muokattavaksi ja simuloitavaksi millä tahansa Escher- tai Escher-FBA-työkalulla (kuva 2d). Kun kyseessä on iMM904:n kaltainen suurempi malli, kaikki reaktiot eivät näy kerralla, mutta voit lisätä reaktion visualisointiin. Napsauta ensin joko sivupalkissa olevaa jakoavaimen kuvaketta tai valitse Muokkaa-valikosta Lisää reaktiotila. Nyt reaktioita voidaan lisätä napsauttamalla mitä tahansa kohtaa kartalla ja valitsemalla haluttu reaktio pudotusvalikosta. Tekstinsyöttökenttää voidaan käyttää kiinnostavan reaktion etsimiseen.
Escher-FBA:n soveltaminen mikrobiologisten solutehtaiden suunnitteluun
Esimerkkinä tutkimushypoteesista, jota voidaan testata Escher-FBA:n avulla, latasimme E. coli -bakteerin genomimittakaavan mallit, jotka sisälsivät kaksi reittiä, joilla voidaan valmistaa 1-propanolia kemiallista tuotantoa varten. Näitä reittejä analysoitiin äskettäin tutkimuksessa, joka käsitteli genomin mittakaavan mallien ennustusvoimaa todellisten mikrobien solutehtaiden kantojen simuloinnissa . Ensimmäinen malli sisältää yhden reitin 1-propanolin tuotantoon (lisätiedosto 1), jonka Atsumi et al. raportoivat ensimmäisen kerran. Toinen malli sisältää kaksi synergististä reittiä 1-propanolin tuotantoon (lisätiedosto 2), joista ensimmäisenä raportoivat Shen ja Liao . Kumpikin malli voidaan ladata erikseen (Model > Load COBRA model JSON -valikkopainikkeella), ja mukana on yksi kartta keskeisestä aineenvaihdunnasta, joka on yhteensopiva molempien mallien kanssa (Additional file 3, voidaan ladata Map > Load Map JSON -valikkopainikkeella).
Olimme uteliaita, onko 1-propanolin tuotantoon tähtäävällä synergistisellä lähestymistavalla – jolla tiedetään olevan korkeampi tuotostuotto – myös eroa vaadittavassa polkujen käytössä. Siksi latasimme jokaisen mallin erikseen, maksimoimme 1-propanolin erittymisen (veimme leijan EX_1poh_e:n päälle ja napsautimme Maximize (maksimointi)), asetimme erittymisen alarajaksi 99 prosenttia maksimista ja minimoimme sitten virtauksen pentoosifosfaattipolun ensimmäisen sitoutuneen vaiheen, glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasin (G6PDH2r), läpi. Tuloksena saadut kartat osoittavat, että 1-propanolin tuotannon synergistiset polut ovat stoikiometrisesti tasapainossa glykolyysin kanssa, joten ne eivät vaadi PPP-aktiivisuutta (kuva 3b). Toisaalta yksittäinen reitti vaatii merkittävää PPP-virtausta (kuva 3a). Myös muuta reitin käyttöä, kuten kussakin tapauksessa tarvittavaa TCA-virtausta, voidaan tutkia näistä kartoista.
Polkujen käyttö kahdella heterologisella reitillä 1-propanolin tuotantoon E. coli:ssa. Kutakin heterologista tuotantoreittiä varten tarvittavaa pentoosifosfaattireitin (PPP) virtausta voidaan verrata ensinnäkin pakottamalla 1-propanolin tuotanto 99 prosenttiin maksimiarvosta (asettamalla 1-propanolin vaihtoreaktion alaraja) ja toiseksi minimoimalla PPP:n ensimmäisen vaiheen kautta kulkeva virta. (a) Atsumin ym. raportoima 1-propanolin polku käyttää yhtä polkua 1-propanolin tuotannon saavuttamiseksi. Se vaatii merkittävää PPP-virtausta ja sen kokonaistuotos on pienempi. (b) Shenin ja Liaon raportoima reitti käyttää synergisesti kahta reittiä suuremman tuoton saavuttamiseksi. Polku on stoikiometrisesti tasapainossa glykolyysin kanssa, joten se ei vaadi PPP-virtausta
Vaikka Escher-FBA:ta voidaan jo käyttää moniin FBA-simulaatioihin suoraan verkkoselaimessa, useita Orthin ym. esittelemistä esimerkeistä ei voida tällä hetkellä toteuttaa Escher-FBA:lla . Tällä hetkellä Escher-FBA ei pysty suorittamaan sellaisia toimintoja kuin geenien knockout-analyysi tai robustisuusanalyysi. Escher-FBA käyttää kuitenkin joustavia SVG-esityksiä visuaalisia elementtejä varten, joten robustisuusanalyysi ja jopa graafisia ominaisuuksia, kuten vaihetasoja, voitaisiin lisätä. Olemme laatineet Escher-FBA:lle kehityssuunnitelman (saatavilla kotisivulta https://sbrg.github.io/escher-fba) ja iteratiivisen kehitysprosessin, jonka avulla voimme lopulta mahdollistaa monimutkaisen systeemibiologian analyysin verkkoselaimessa.