Study population
Tämä tutkimus perustuu HAPIEE-kohortteihin (Health, Alcohol and Psychosocial factors in Eastern Europe) Puolasta, Tšekin tasavallasta ja Liettuasta sekä saksalaisen ESTHER-kohortin (saksankielinen nimi: ”Epidemiologische Studie zu Chancen der Verhütung, Früherkennung und optimierten Therapie chronischer Erkrankungen in der älteren Bevölkerung”) kahdeksanvuotiseen seurantaan.
Kokonaisuudessaan HAPIEE-tutkimus käsittää kohortteja neljässä maassa. Koska verinäytteitä ei ollut mahdollista viedä Venäjältä, vain kolme kohorttia otettiin mukaan tähän analyysiin. Tutkimukseen osallistujat rekrytoitiin kuudessa tšekkiläisessä kaupungissa (Havirov/Karvina, Hradec Kralove, Jihlava, Kromeriz, Liberec ja Usti nad Labem) vuosina 2002-2005 (n = 8 857), Krakovassa, Puolassa, vuosina 2002-2005 (n = 10 728) ja Kaunasissa, Liettuassa, vuosina 2006-2008 (n = 7 161). Kukin kohortti koostuu satunnaisotoksesta miehiä ja naisia, jotka olivat lähtötilanteessa 45-75-vuotiaita ja jotka on ositettu sukupuolen ja viiden vuoden ikäryhmien mukaan ja valittu väestörekistereistä. Yleinen vastausprosentti oli 61 prosenttia. Tiedot kerättiin kyselylomakkeella ja lyhyellä klinikkatutkimuksella, jonka aikana otettiin paastoverinäyte laskimoverestä.
ESTHER-tutkimus on väestöpohjainen kohortti, johon kuului 9 949 aikuista, jotka olivat lähtötilanteessa 50-74-vuotiaita ja jotka yleislääkärit rekrytoivat tavanomaisen terveystarkastuksen yhteydessä vuosina 2000-2002 Saksan osavaltiossa Saarlandissa. Tämä tutkimus perustuu heinäkuun 2008 ja joulukuun 2010 välisenä aikana toteutettuun kahdeksan vuoden seurantaan, jolloin tutkimukseen osallistuneet olivat 56-85-vuotiaita. Lähtötilanteen ja kahdeksan vuoden seurannan välisenä aikana 499 henkilöä oli kuollut, 505 henkilöä ei voinut enää osallistua tutkimukseen huonon terveydentilan vuoksi ja 680 henkilöä oli kieltäytynyt osallistumasta tutkimukseen. Jäljelle jääneistä 8 265 osallistujasta 6 061 lähetti kyselylomakkeen takaisin (vastausprosentti 73,4 %) ja 4 637 luovutti verinäytteen yleislääkärin vastaanotolla. Tutkimukseen osallistuneiden yleislääkärit täyttivät myös kyselylomakkeen tutkimukseen osallistuneiden terveydentilasta (käytettävissä n = 5 997). Lisäksi 3124 tutkimukseen osallistunutta suostui ylimääräiseen kolmen tunnin geriatriseen arviointiin, jonka tutkimuslääkärit suorittivat osallistujien kotona.
ESTHER- ja HAPIEE-tutkimusten muuttujat yhdenmukaistettiin ja oksidatiivisen stressin merkkiaineet mitattiin Consortium on Health and Ageing -järjestön puitteissa: Network of Cohorts in Europe and the United States (CHANCES; www.chancesfp7.eu), joka on kuvattu muualla . Tutkimukset on toteutettu Helsingin julistuksen mukaisesti, ja kaikilta tutkimukseen osallistuneilta saatiin kirjallinen tietoinen suostumus.
Etiikka, suostumus ja luvat
Sisältyneet tutkimukset hyväksyttiin asianomaisissa paikallisissa eettisissä toimikunnissa (ESTHER: Heidelbergin yliopiston lääketieteellinen tiedekunta ja Saarlandin lääketieteellinen yhdistys; HAPIEE: University College London (Iso-Britannia), Kansallinen kansanterveysinstituutti (Prahassa, Tšekin tasavallassa), Jagiellonian-yliopisto (Krakovassa, Puolassa) ja Liettuan terveystieteiden yliopisto (Kaunasissa, Liettuassa)). Kaikilta analysoituihin tutkimuksiin osallistuneilta osallistujilta on saatu kirjallinen tietoinen suostumus, ja tutkimukset on toteutettu Helsingin julistuksen mukaisesti.
Muuttujien arviointi
ESTHER- ja HAPIEE-tutkimuksissa sosiodemografiset tiedot, elintapoja koskevat tiedot ja sairaushistoriaa koskevat tiedot arvioitiin itse täytetyillä kyselylomakkeilla. Pituus ja paino mitattiin ja niitä täydennettiin itse ilmoitetuilla tiedoilla ESTHERissa niiden tutkimukseen osallistuneiden osalta, jotka eivät suostuneet kotikäyntiin. Itseraportoitujen tietojen lisäksi yleisten kroonisten sairauksien historia vahvistettiin ESTHER-tutkimuksessa tutkimalla sairauskertomuksia tai Saarlandin syöpärekisteriä. Munuaisten vajaatoiminta määriteltiin arvioidulla glomerulussuodatusnopeudella <60 ml/min/1,73 m2 , joka laskettiin kreatiniinipohjaisella Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration -yhtälöllä . ESTHER-kohortissa seerumin kreatiniinipitoisuudet arvioitiin kineettisellä Jaffé-menetelmällä Cobas 8000 C701 -laitteella (analyytti: CREJ2 3000, Roche). Kokonaiskolesteroli ja suuren tiheyden lipoproteiinikolesteroli (HDL) arvioitiin seeruminäytteistä entsymaattisella kromatografialla (analyytit: Chol2 2100, HDLC3 450, Roche) ja C-reaktiivinen proteiini (CRP) immunoturbidimetrialla Cobas 8000 C701 -laitteella (analyytti: CRPL3 500, Roche). HAPIEE:ssä arvioitiin myös kokonais- ja HDL-kolesteroli samalla määritysmenetelmällä ja Roche-analyytillä, mutta käytettiin eri autoanalysaattoreita (HAPIEE Tšekki ja Liettua: Roche Cobas Mira; HAPIEE Puola: Hitachi 917/Modular P). Lisäksi kaikissa HAPIEE-kohorteissa seerumin kreatiniini ja CRP arvioitiin samalla menetelmällä kuin ESTHERissa, mutta eri toimittajan (Beckman-Coulter) analyyttejä käyttäen ja eri autoanalysaattorilla (LX-20 Pro, Beckman-Coulter).
Kuolleisuuden toteaminen
Näissä analyyseissä käytimme kokonaiskuolleisuuden seurantaa virallisista koko maan kattavista (Tšekki, Saksa), paikallisista (Liettua) tai alueellisista (Puola) kuolleisuusrekistereistä 31. joulukuuta 2010 asti Puolassa, 31. joulukuuta 2011 asti Tšekissä ja Liettuassa ja 31. heinäkuuta 2014 asti Saksassa. Saksassa syykohtainen kuolleisuus oli saatavilla vain 2. huhtikuuta 2013 asti tapahtuneista kuolemantapauksista. Rekisterit olivat täydelliset kaikkien niiden osallistujien osalta, jotka eivät muuttaneet rekisterin kattaman alueen ulkopuolelle. Seurantahäviö muuttoliikkeen vuoksi oli 4 prosenttia HAPIEE-kohorteissa (yhteensä) ja 2 prosenttia ESTHER-tutkimuksessa. Kaikki ICD-10-koodeilla I00-I99 koodatut kuolemat katsottiin sydän- ja verisuonitautikuolemiksi, ja syöpäkuolemat määriteltiin ICD-10-koodeilla C00-C97.
Oksidatiivisen stressin seerumin merkkiainemittaukset
D-ROMs-pitoisuuksien (Diacron, Grosseto, Italia) ja TTL:n (Rel Assay Diagnostics, Gaziantep, Turkki) mittaamiseen käytetyt määritykset sovitettiin automaattiseen analysaattoriin (LX20-Pro, Beckman-Coulter, Woerden, Alankomaat) terveydensuojelututkimuksen laboratoriossa (Bilthoven, Alankomaat) aiemmin kuvatulla tavalla . d-ROMs-määritys mittaa hydroperoksidipitoisuuden Carratelli-yksikköinä (Carr U), jotka on nimetty määrityksen keksijän Mauro Carratellin mukaan. Jokainen Carr U vastaa 0,08 mg vetyperoksidia (H2O2)/100 ml näytettä. TTL-määritys mittaa vapaiden tioliryhmien pitoisuutta näytteessä μmol/l.
Mittaukset suoritettiin seeruminäytteistä, joita oli säilytetty noin 3-10 vuotta pakastimissa -80 °C:n lämpötilassa. d-ROM:ien ja TTL:n pitkäaikaisstabiliteetti on hyvä näissä olosuhteissa . ESTHERin kahdeksan vuoden seurannassa d-ROM ja TTL mitattiin kaikilta osallistujilta, jotka luovuttivat verinäytteitä yleislääkärin vastaanotollaan (n = 4637). Mittaukset tehtiin kuitenkin kahtena eri ajankohtana, koska kesäkuussa 2012 tehdyssä pilottitutkimuksessa ei ollut rahoitusta kaikkien näytteiden mittaamiseen. Määritysten mahdollisten siirtymien korjaamiseksi mitattiin 80 näytettä ajanhetkestä 1 (kesäkuu 2012) uudelleen ajanhetkestä 2 (syyskuu 2014), ja saatiin lineaariset regressioyhtälöt, joita käytettiin vakioimaan ajanhetkestä 2 saadut tulokset ajanhetkestä 1 saatuihin tasoihin, jolloin myös HAPIEE-kohorttien mittaukset suoritettiin (koko vuoden 2012 ajan). D-ROM-mittausten yhdenmukaisuus oli korkea (Spearmanin korrelaatiokerroin r = 0,92 ja keskiarvojen ero = 15 Carr U), joten korjauksia ei sovellettu. TTL:n osalta selvä siirtymä määritystuloksissa (r = 0,88 ja keskiarvojen ero = 81 μmol/l) korjattiin soveltamalla seuraavaa yhtälöä kaikkiin ajanhetken 2 mittauksiin: TTLaika-piste2 = 0,746 × TTLaika-piste1. Lisäksi jätimme pois 610 mittausta verinäytteistä, jotka eivät täyttäneet ESTHER-tutkimuksen tiukkoja hemolyyttisiä, ikterisiä ja lipeemisiä laatukriteerejä, joten tässä tutkimuksessa analysoitavaksi jäi 4 027 mittausta. HAPIEE-kohorteissa niiden näytteiden määrä, jotka eivät täyttäneet näitä laatukriteerejä, oli vähäinen.
Analyyttinen tutkimusnäyte
Rajallisen rahoituksen vuoksi d-ROM-pitoisuuksia ja TTL:ää ei mitattu kaikilta HAPIEE-kohorttien osallistujilta, vaan sen sijaan otettiin käyttöön sovitettu tapauskontrollirakenne (Lisätiedosto 1: Kuva S1). Tapauksiksi määriteltiin kaikki koehenkilöt, jotka kuolivat seurannan aikana (n = 1 433) tai saivat sydäninfarktin (MI) tai aivohalvauksen, joka ei johtanut kuolemaan (n = 658). Kontrolliryhmät (n = 4 396) sovitettiin tapauksiin sukupuolen ja 5 vuoden ikäryhmien mukaan. Kuolleisuusanalyysin sydäninfarktin ja aivohalvauksen ylinäytteenoton korjaamiseksi potilaat, joilla oli seurannan aikana kuolemaan johtamaton sydäninfarkti tai aivohalvaus, jätettiin ensimmäisessä vaiheessa pois tapausten joukosta. Jotta kontrolleihin voitiin lisätä edustava otos henkilöistä, joilla oli kuolemaan johtamaton aivoinfarkti tai aivohalvaus, laskettiin toisessa vaiheessa kuolemaan johtamattomien aivoinfarkti- tai aivohalvaustapahtumien havaittu osuus kussakin ikä- ja sukupuolikohtaisessa ositteessa koko kohortista. Kolmannessa vaiheessa nämä osuudet kerrottiin kunkin osion otoskoolla kontrolleissa, joissa oli mitattuja oksidatiivisen stressin merkkiaineita. Neljännessä vaiheessa tulokseksi saadut lukumäärät valittiin satunnaisesti kussakin ositteessa niiden henkilöiden joukosta, joilla oli kuolemaan johtamaton aivoinfarkti tai aivohalvaus, ja ne lisättiin kontrolleihin, jolloin saatiin 4 552 sopivaa kontrollia 1 433 kuolemantapausta varten. Viimeisessä vaiheessa kelvollisten kontrollien poolia käytettiin, jotta jokaiseen kuolemantapaukseen saatiin yksilöllisesti täsmälleen kaksi kontrollia kohortin, sukupuolen ja iän (±5 vuotta) mukaan.
Statistiset analyysit
Tapausten (kuolemantapaukset seurannan aikana) ja kontrollien välisiä perusominaisuuksien eroja arvioitiin χ2-testillä kategoriallisten muuttujien osalta ja Wilcoxonin ranksummatestillä jatkuvien muuttujien osalta. Kuolleisuuden vakiintuneiden riskitekijöiden ja korkeiden oksidatiivisen stressin tasojen poikkileikkausyhteyksiä arvioitiin logistisilla regressiomalleilla, jotka sisälsivät kaikki kategorisina muuttujina mallinnetut lähtötason ominaisuudet (taulukko 1). Riippuvainen muuttuja ”korkea oksidatiivinen stressi” määriteltiin kahdella eri määritelmällä, jotka perustuivat d-ROM-tasoihin tai TTL:ään. Valmistajan ohjeiden mukaisesti d-ROM-tasojen osalta käytettiin kliinistä raja-arvoa >400 Carr U, joka luokitteli 23 prosenttia ESTHER-kohortista ja 30 prosenttia HAPIEE-kohortin kelvollisista kontrolleista ”korkean” oksidatiivisen stressin luokkaan. TTL:n osalta kliinisiä raja-arvoja ei ole saatavilla, ja koska määritystä ei ole vielä standardoitu, populaatiokeskiarvot vaihtelivat voimakkaasti kohorttien välillä. Sen vuoksi d-ROM-tasoihin perustuvan määritelmän mukaisen korkean oksidatiivisen stressin omaavien henkilöiden osuuden vastaamiseksi käytettiin alinta kohorttikohtaista TTL-kvartiilia (25 %), jotta koehenkilöt voitiin luokitella TTL:n perusteella korkean oksidatiivisen stressin luokkaan. Poikkileikkausanalyysit tehtiin kaikille koehenkilöille ja erikseen naisille ja miehille.
Pitkittäisanalyysejä varten, Cox-proportionaalista hazard-regressiota (ESTHER-kohortti) ja ehdollista logistista regressiota (HAPIEE:n täsmäytetty tapaus-verrokkitutkimus) käytettiin arvioitaessa vaarasuhteita (hazard ratios) ja todennäköisyyssuhteita (odds ratios) vastaavasti d-ROMs-tasojen nousulle ja TTL:n laskulle yhdellä kohorttikohtaisella standardipoikkeamalla (SD). Lisäksi d-ROMs-tasot mallinnettiin myös kategorisena muuttujana, jossa käytettiin valmistajan suosittelemia kliinisiä raja-arvoja kohtalaiselle (341-400 Carr U), korkealle (401-500 Carr U) ja erittäin korkealle oksidatiiviselle stressille (>500 Carr U) suhteessa koehenkilöihin, joiden oksidatiivinen stressi ei ollut lisääntynyt tai oli alhainen (≤340 Carr U). Kun absoluuttinen riski on pieni, logistinen ja Cox-regressio tuottavat yleensä samankaltaisia tuloksia, ja kertoimen suhdelukua voidaan pitää tarkemman vaarasuhteen likiarvona. Käytimme termiä suhteellinen riski (RR) molemmista vaikutusarvioista. Herkkyysanalyysissä ESTHER-kohortin syykohtaista kuolleisuutta koskevissa analyyseissä otettiin huomioon muista syistä johtuvan kuoleman kilpaileva riski sovittamalla regressiomalli suhteellisella subdistribuutio-vaarojen regressiomallilla, jossa painotettiin ne koehenkilöt, joille oli aiheutunut kilpailevan riskin tapahtuma Fine- ja Gray-menetelmän laajennuksen mukaisesti . Tulokset olivat kuitenkin lähes identtiset perinteisen Coxin proportional hazard -regression kanssa, ja siksi tässä käsikirjoituksessa esitetään vain jälkimmäiset tulokset.
Analyysit tehtiin erikseen kullekin kohortille, ja ne yhdistettiin meta-analyysillä, jossa käytettiin Mantel-Haenszel-painotusta ja satunnaisvaikutuksia , ottaen huomioon kohorttien otoskoko ja tutkimusten välisen tilastollisen heterogeenisuuden mahdollisuus. Jälkimmäistä tarkasteltiin Cochranen Q-testillä ja I2-tilastolla.
Analysoitiin seuraavat lopputulokset: kuolleisuus kaikkiin syihin, CVD:hen, syöpään ja muihin kuin CVD:hen ja muihin kuin syöpäsairauksiin. Kullekin lopputulokselle kehitettiin neljä tilastollista mallia, ja malleihin sisällytettiin yhä enemmän vakiintuneita kuolleisuuden riskitekijöitä. Sekä d-ROM-tasot että TTL sisällytettiin aina samaan malliin, koska niiden välinen korrelaatio oli alhainen (r <0,08 kussakin kohortissa). Mallissa 1 tehtiin ESTHER-kohortissa iän ja sukupuolen mukainen mukautus, kun taas HAPIEE-kohorttien kohdalla tämä ei ollut tarpeen, koska tapaukset sovitettiin yksilöllisesti kahteen kontrolliin iän ja sukupuolen mukaan ja analysoitiin stratifioidussa analyysissä, jossa ositteet koostuvat sovitettujen sarjojen kokoelmasta. Mallissa 2 otettiin lisäksi huomioon koulutus, painoindeksi (BMI), tupakointi, alkoholinkäyttö ja fyysinen aktiivisuus. Malliin 3 sisällytettiin myös sairaudet, jotka voivat mahdollisesti välittää oksidatiivisen stressin yhteyttä kuolleisuuteen (eli dyslipidemia (arvioituna kokonais- ja HDL-kolesterolilla), munuaisten vajaatoiminta, aiempi diabetes, verenpainetauti, sydänkohtaus, aivohalvaus ja syöpä). Lopuksi mallia 4 mukautettiin lisäksi CRP-tasoilla, jotka korreloivat voimakkaasti d-ROM-tasojen kanssa (r = 0,34-0,41 kohorteissa) ja vähemmän voimakkaasti TTL:n kanssa (r = 0,11-0,17 kohorteissa). Ikä mallinnettiin jatkuvana muuttujana ja kaikki muut muuttujat kategorisina muuttujina (luokat on esitetty taulukossa 1). Testasimme d-ROM:n/TTL:n ja kovariaattoreiden väliset vuorovaikutukset lisäämällä malliin 2 asianmukaiset vuorovaikutustermit.
Analysoitavat alaryhmät valittiin ennakkoon siten, että pyrittiin osittamaan korkeiden oksidatiivisen stressin tasojen tärkeimpien potentiaalisten määräävien tekijöiden mukaan: kohortti/maa, ikä, sukupuoli, sydäninfarkti- tai syöpähistoria ja tulehdustila. Otoskoon rajallisuuden vuoksi ositetut analyysit rajoitettiin koskemaan kuolleisuutta kaikkiin syihin, sydän- ja verisuonitauteihin ja syöpään. Käänteisen kausaaliharhan mahdollisuuden välttämiseksi analyysit tehtiin erikseen tapahtumista, jotka tapahtuivat seurantavuosina 1-2, 3-4 ja 5-6. Otoskokorajoitusten vuoksi tämä ositettu analyysi voitiin tehdä vain kokonaiskuolleisuuden osalta. Mallin epävakauden välttämiseksi kohorttikohtaisen alaryhmäanalyysin tulos otettiin huomioon meta-analyysissä vain silloin, kun alaryhmässä esiintyi vähintään 25 tapahtumaa.
Lisätiedostossa 1: Taulukko S1 esitettyjen puuttuvien lähtötilanteen kovariaattiarvojen lukumäärän imputointiin käytettiin moninkertaista imputointia. Puuttuvien arvojen osuus oli alle 5 % kaikkien muuttujien osalta lukuun ottamatta alkoholinkäyttöä ja fyysistä aktiivisuutta, joiden osalta puuttuvia arvoja oli jopa 22 %. Tietojemme mukaan tiedot puuttuivat satunnaisesti, mikä on moninkertaisen imputoinnin oletus. Kohortin, tapausaseman ja sukupuolen mukaan erikseen 20 täydellistä tietosarjaa imputoitiin SAS 9.3 -proseduurilla ”PROC MI” käyttäen Markovin ketjun Monte Carlo -menetelmää. Imputointimallissa käytettiin ”täydellisen” mallin muuttujia. Kaikki monimuuttuja-analyysit tehtiin 20 imputoidulle tietokokonaisuudelle, ja yksittäisten tietokokonaisuuksien tulokset yhdistettiin SAS 9.3 -proseduurilla ”PROC MIANALYZE”.
Meta-analyysit tehtiin tilastollisella ohjelmalla Comprehensive Meta-Analysis 2.0 (Biostat, Englewood, NJ, USA). Kaikki muut analyysit tehtiin SAS-ohjelmalla, versio 9.2 (Cary, Pohjois-Carolina, Yhdysvallat). Kaikki tilastolliset testit olivat kaksipuolisia käyttäen alfa-tasoa 0,05.