Frontiers | Genetic and Molecular Mechanisms Underlying Symbiotic Specificity in Legume-Rhizobium Interactions | Plant Science

Introduction
Flavonoidien ja flavonoidi-NodD-tunnistuksen välittämä spesifisyys
Nod-faktoreiden havaitsemisen välittämä spesifisyys
Ritsobioiden eksopolysakkaridien havaitsemisen välittämä spesifisyys
Isännän sisäisen immuniteetin välittämä spesifisyys
Spesifisyys typen kiinnittymisessä
Johtopäätökset ja tulevaisuuden näkymät
Author Contributions
Rahoitus
Conflict of Interest Statement

Introduction

Legumin ja rhizobiumin symbioosi alkaa isäntäkasvin ja sen mikrosymbiontin välisellä signaalinvaihdolla (Oldroyd, 2013). Yhteensopivien bakteerien tunnistaminen isäntäkasvin toimesta saa aikaan kortikaalisten solujen jakautumisen juurikäävän primordioiden muodostamiseksi ja käynnistää samalla infektioprosessin bakteerien kuljettamiseksi kyhmysoluihin. Useimpien palkokasvien infektioon liittyy kasvin tekemien infektiokierteiden kehittyminen, jotka saavat alkunsa juurikarvoista. Jakautuvia bakteereja sisältävät infektiokierteet kasvavat epidermiksen solukerroksen läpi kyhmysoluihin, joissa bakteerit vapautuvat ja sisäistyvät endosytoosin kaltaisessa prosessissa. Kyhmyruususoluissa yksittäisiä bakteereja ympäröi kasviperäinen kalvo, joka muodostaa symbioosiksi kutsutun organellin kaltaisen rakenteen, jonka sisällä bakteerit edelleen erilaistuvat typpeä sitoviksi bakteroideiksi (Jones ym., 2007; Oldroyd ym., 2011).

Symbioottisten kyhmyruususolujen kehitykseen kuuluu sekä kyhmyruususolujen että bakteerisolujen synkroninen erilaistuminen. Palkokasvien kyhmyjä voidaan ryhmitellä kahteen päätyyppiin: epämääräisiin (esim. herne, apilat ja Medicago) ja määräisiin (esim. soija, härkäpapu ja Lotus) (Nap ja Bisseling, 1990; Hirsch, 1992). Epämääräiset kyhmyjuuret saavat alkunsa sisemmän kuoren solunjakautumisesta, ja niillä on pysyvä apikaalinen meristemi. Näin ollen epämääräiset kyhmyt ovat muodoltaan sylinterimäisiä, ja niissä on kehitysgradientti kärkipisteestä kyhmyn tyvelle, joka voidaan jakaa eri kyhmyvyöhykkeisiin (Nap ja Bisseling, 1990). Sitä vastoin determinoituneet kyhmyt syntyvät juuren keski- tai ulkokuoressa tapahtuvista solunjakautumisista, niillä ei ole pysyvää meristemiä ja ne ovat muodoltaan pallomaisia. Determinatiivisen kyhmykeuhkon solunjakautuminen loppuu varhaisissa kehitysvaiheissa, ja kypsä kyhmykeuhko kehittyy solujen laajentumisen kautta; näin ollen infektoituneet solut kehittyvät enemmän tai vähemmän synkronisesti typensidontavaiheen kanssa. Molemmissa solukkotyypeissä symbioottisten solujen genomi endoreduplikoituu, mikä johtaa polyploidisaatioon ja solujen laajentumiseen. Samanaikaisesti kyhmysolujen kehityksen kanssa tapahtuu typpeä sitovien bakteerien erilaistuminen. Bakteerien erilaistuminen voi olla isäntäkasvustosta riippuen mutta kyhmytyypistä riippumatta lopullista tai palautuvaa. Terminaaliselle erilaistumiselle on ominaista genomin endoreduplikaatio, solujen pidentyminen, lisääntynyt kalvojen läpäisevyys ja lisääntymiskyvyn menettäminen, kun taas reversiibelissä erilaistumisessa bakteeroidit säilyttävät solujen koon ja DNA-pitoisuuden, joka on samanlainen kuin vapaasti elävillä bakteereilla (Kereszt ym. ym., 2011; Oldroyd ym. ym. ym. ym. ym. ym. ym. ym. ym. ym. ym. ym. ym. ym. ym. ym. ym. ym. ym. ym. yht.) Verrattuna vapaasti eläviin bakteereihin bakteeroidit osoittavat dramaattisia muutoksia transkriptomissa, solun pintarakenteessa ja metabolisissa aktiviteeteissa niin, että ne sopeutuvat paremmin solunsisäiseen ympäristöön ja omistautuvat typensidontaan (Mergaert ym., 2006; Prell ja Poole, 2006; Haag ym., 2013).

Kumpikin palkokasvi- ja juurikääpäbakteereista on fylogeneettisesti monimuotoinen. Mikään yksittäinen rhizobiaalikanta ei voi muodostaa symbioosia kaikkien palkokasvien kanssa ja päinvastoin. Spesifisyyttä esiintyy sekä laji- että genotyyppitasolla (Broughton ym., 2000; Perret ym., 2000; Wang ym., 2012). Tämä voi tapahtua vuorovaikutuksen varhaisissa vaiheissa siten, että samat bakteerikannat voivat infektoida ja noduloida yhtä isäntäkasvia mutta eivät toista (Yang ym., 2010; Wang ym., 2012; Tang ym., 2016; Fan ym., 2017). Yhteensopimattomuutta esiintyy usein myös kyhmyjen kehityksen myöhemmissä vaiheissa siten, että typensidonnan tehokkuus vaihtelee merkittävästi eri kasvi-bakteeriyhdistelmien välillä (Wang ym., 2012, 2017, 2018; Yang ym., 2017). Symbioottinen spesifisyys on seurausta sekä isäntä- että bakteeripuolelta tulevien signaalien vaihtumisesta; näin ollen erilaiset tunnistamismekanismit ovat kehittyneet yhteisadaptaatioprosessin aikana. Symbioottisen spesifisyyden geneettisen ja molekulaarisen perustan tuntemus on tärkeää, jotta voidaan kehittää välineitä isännän tai bakteerien geneettiseen manipulointiin typen sidonnan tehokkuuden parantamiseksi. Tässä katsauksessa käsittelemme nykyistä käsitystämme spesifisyyden evoluutiosta juurisolmukesymbioosissa.

Flavonoidien ja flavonoidi-NodD-tunnistuksen välittämä spesifisyys

Typpeä rajoittavissa olosuhteissa palkokasvien juuret erittävät ritsosfääriin flavonoidiyhdisteiden cocktailin, ja ne aktivoivat bakteerien nodulaatio- (nod) geenien ryhmän ilmentymistä, mikä johtaa Nod-tekijän synteesiin, lipokito-oligosakkaridiseen signaaliin, joka on välttämätön symbioottisen kehityksen käynnistymiselle useimmissa palkokasveissa (Oldroyd et al., 2011). Nod-geenien ilmentymisen indusointia välittävät flavonoidien aktivoimat NodD-proteiinit, jotka ovat LysR-tyyppisiä transkription säätelijöitä (Long, 1996). NodD-proteiinit aktivoivat nod-geenien ilmentymistä sitoutumalla konservoituihin DNA-motiiveihin (nod box) nod-operonien yläjuoksulla (Rostas ym., 1986; Fisher ym., 1988).

Eri rhizobioiden NodD-proteiinit ovat sopeutuneet tunnistamaan eri palkokasvien erittämiä erilaisia flavonoideja, ja tämä tunnistusspesifisyys määrittelee symbioosin varhaisen tarkistuspisteen (Peck ym., 2006). Vaikka näiden kahden molekyylin välisestä fyysisestä vuorovaikutuksesta ei ole suoraa näyttöä, flavonoidien on osoitettu voivan stimuloida NodD:n sitoutumista nod-geenin promoottoreihin Sinorhizobium melilotissa (Peck ym., 2006). On hyvin dokumentoitu, että nodD-geenien vaihtaminen kantojen välillä voi muuttaa vastaanottajakannan vastetta erilaisille flavonoidi-induktoreille ja siten isäntävalikoimaa (Horváth ym., 1987; Perret ym., 2000). Esimerkiksi nodD1:n siirto laajan isäntäalueen symbiontista Rhizobium sp. NGR234 rajoitetun isäntäalueen kantaan Rhizobium leguminosarum biovar trifolii ANU843 mahdollisti sen, että vastaanottajakanta pystyi noduloimaan ei-palkokasvia Parasponia, koska laajan isäntäalueen NodD1-proteiini kykenee tunnistamaan laajemman kirjon flavonoidi-induktoreja (Bender et al., 1988).

Todisteet flavonoidien merkityksestä isäntäalueen määrittämisessä ovat peräisin pääasiassa bakteerien genetiikasta, ja asiaan liittyviä kasvigeenejä on tutkittu vähemmän. Koska palkokasvien juuret erittävät monimutkaista sekoitusta flavonoidiyhdisteitä, on vaikea määritellä tarkasti, mitkä flavonoidit ovat kriittisemmässä asemassa ja milloin ja missä niitä tuotetaan. Viimeaikaiset tutkimukset soijapavulla ja Medicago truncatulalla ovat tuoneet esiin keskeisiä flavonoideja, joita tarvitaan rhizobiainfektiossa (katsaus artikkelissa Liu ja Murray, 2016). Nämä niin kutsutut ”infektioflavonoidit” ovat voimakkaita nod-geenien indusoijia, niitä erittyy juurista, niitä kertyy runsaasti infektiokohtiin ja niiden biosynteesi lisääntyy vastauksena yhteensopivien rhizobioiden aiheuttamaan infektioon. Vaikka luteoliini oli ensimmäinen tunnistettu flavonoidi, joka voi indusoida nokkosgeenin ilmentymistä useilla eri rhizobiobikannoilla, se ei ole palkokasvispesifinen, sitä tuotetaan pääasiassa itävistä siemenistä eikä sitä ole havaittu juurten eksudaateissa tai kyhmyissä. Sitä vastoin metoksikalkonin on osoitettu olevan yksi Medicagon ja lähisukulaispalkokasvien vahvoista isäntäinfektiosignaaleista, jotka muodostavat epämääräisiä kyhmyjä, kun taas genisteiini ja daidzeiini ovat ratkaisevia signaaleja soijapavuista, jotka muodostavat määräytyviä kyhmyjä. Osa flavonoidiyhdisteistä voi toimia myös fytoaleksiineinä, jotka vahvistavat symbioosin spesifisyyttä (Liu ja Murray, 2016). Esimerkiksi Bradyrhizobium japonicum ja Mesorhizobium loti, mutta ei Medicago-symbiontti S. meliloti, ovat herkkiä Medicago spp. tuottamalle isoflavonoidi medicarpinille (Pankhurst ja Biggs, 1980; Breakspear ym, 2014), ja soijasymbiontit B. japonicum ja S. fredii ovat resistenttejä glykeoliinille, kun ne altistuvat genisteiinille ja daidzeiinille (Parniske ym., 1991).

Nod-faktoreiden havaitsemisen välittämä spesifisyys

Riisobioiden tuottamat nod-faktorit ovat olennainen merkkikomponentti symbioosin kehittymiselle useimmissa palkokasveissa. Nod-faktorit ovat lipokito-oligosakkarideja, jotka koostuvat neljästä tai viidestä 1,4-sidoksisesta N-asetyyliglukosamiinijäännöksestä, joissa on vaihtelevan pituinen rasva-asyliketju kiinnittyneenä pelkistymättömän pään C-2-asemaan ja erilaisia lajikohtaisia kemiallisia koristeita sekä pelkistyvässä että pelkistymättömässä päässä (Dénarié et al., 1996). Yleiset nodABC-geenit osallistuvat kitiinin selkärangan synteesiin, kun taas muut kantakohtaiset nod-geenit muokkaavat selkärankaa muuttamalla asyyliketjun kokoa ja kylläisyyttä tai lisäämällä päätesokeriryhmiin asetyyli-, metyyli-, karbamoyyli-, sulfuryyli- tai glykosyyliryhmiä. Nod-tekijöiden rakenteelliset vaihtelut ovat keskeinen isäntäkasvin levinneisyysalueeseen vaikuttava tekijä, koska isännän on tunnistettava nämä Nod-tekijät, jotta infektio ja nodulaatio käynnistyvät (Perret et al., 2000; D’Haeze ja Holsters, 2002).

Nod-faktorit havaitsevat Nod-faktorireseptorit (esim. NFR1 ja NFR5 Lotus japonicus -lajissa), jotka ovat LysM-domeenia sisältäviä reseptorikinaaseja (Limpens ym., 2003; Madsen ym., 2003; Radutoiu ym., 2003). Nod-tekijöiden suora sitoutuminen reseptorikompleksin solunulkoisiin LysM-domeeneihin johtaa jatkoketjun nodulaation signaalireittien aktivoitumiseen (Broghammer ym., 2012). Nod-tekijöiden sitoutumisen spesifisyyttä pidetään yleisesti kriittisenä mahdollisten symbioottisten kumppaneiden tunnistamisen kannalta. Tätä hypoteesia on tuettu vahvasti geneettisellä todistusaineistolla, vaikka tällaista sitoutumispesifisyyttä ei ole pystytty osoittamaan. Parhaat esimerkit ovat peräisin herne-R. leguminosarum -symbioosista, jossa bakteerin nod-geenimutaatiot, jotka johtavat muuttuneeseen Nod-tekijän koostumukseen tai rakenteeseen, osoittivat genotyyppispesifistä nodulaatiota (Firmin et al., 1993; Bloemberg et al., 1995). Tämä isäntäalueen muutos vastaa alleelivariaatioita Sym2/Sym37/PsK1-lokuksessa, joka on NFR1:n ortologinen alue, joka sisältää LysM-reseptorikinaasiklusterin (Zhukov ym., 2008; Li ym., 2011). Tässä tapauksessa alleelinen vaihtelu yhdessä geenien monistumisen ja diversifikaation kanssa vaikuttaa osaltaan symbioottisen yhteensopivuuden muutoksiin.

Nod-tekijöiden tunnistamisella on oletettavasti kriittisempi rooli isäntäalueen määrittelyssä lajitasolla, mitä on parhaiten havainnollistettu bakteerien puolella. Nod-faktorireseptorien luonnollisia polymorfismeja, jotka ovat vastuussa nodulaatiospesifisyydestä eri palkokasvien välillä, ei ole kuitenkaan tutkittu hyvin geneettisellä tasolla yksinkertaisesti siksi, että kasveja ei voida risteyttää keskenään. Kuitenkin L. japonicuksen NFR1- ja NFR5-symbionttien siirtäminen M. truncatulaan mahdollistaa L. japonicuksen symbiontti Mesorhizobium loti:n nodulaation (Radutoiu et al., 2007).

Ritsobioiden eksopolysakkaridien havaitsemisen välittämä spesifisyys

Nod-faktoreiden lisäksi myös ritsobioiden pinnan polysakkarideilla, kuten eksopolysakkarideilla (EPS), lipopolysakkarideilla (LPS) ja kapselipolysakkarideilla (KPS), uskotaan olevan tärkeä merkitys symbioottisten suhteiden syntymiselle (Fraysse et al., 2003; Becker et al., 2005; Jones et al., 2007; Gibson et al., 2008). Näiden pintakomponenttien on ehdotettu kykenevän tukahduttamaan kasvien puolustusta, mutta niiden aktiivinen rooli bakteeri-infektion ja nodulaation edistämisessä on edelleen hämärän peitossa ja riippuu tutkituista erityisistä vuorovaikutussuhteista.

Eksopolysakkaridien on osoitettu olevan välttämättömiä juurikääpäinfektiolle useissa symbioottisissa vuorovaikutussuhteissa. Parhaiten tämä on havainnollistettu Sinorhizobium-Medicago-symbioosissa, jossa S. melilotin tuottama pääasiallinen EPS, sukkinoglykaani, on välttämätön infektioketjujen käynnistymiselle ja pidentymiselle, ja lisääntynyt sukkinoglykaanituotanto parantaa nodulaatiokapasiteettia (Leigh et al., 1985; Reinhold et al., 1994; Cheng ja Walker, 1998; Jones, 2012). EPS:n symbioottinen rooli on kuitenkin hyvin monimutkainen Mesorhizobium-Lotus-vuorovaikutuksessa (Kelly ym., 2013). Esimerkiksi M. loti R7A:n EPS-mutanttien osajoukko osoitti vakavia nodulaatiopuutoksia L. japonicusilla ja L. corniculatusilla, kun taas muut mutantit muodostivat tehokkaita kyhmyjä (Kelly ym., 2013). Erityisesti R7A-mutantit, joilla oli puutteita happaman oktasakkaridisen EPS:n tuotannossa, pystyivät normaalisti noduloimaan L. japonicusta, kun taas exoU-mutantit, jotka tuottivat typistettyä pentasakkaridista EPS:ää, eivät tunkeutuneet isäntään. Ehdotettiin, että täyspitkä EPS toimii signaalina yhteensopiville isännille, jotta kasvin puolustusreaktioita voidaan moduloida ja bakteeri-infektio sallia, ja R7A-mutantit, jotka eivät tuota EPS:ää, voivat välttää tai tukahduttaa kasvien valvontajärjestelmän ja siten säilyttää kykynsä muodostaa kyhmyjä. Sitä vastoin kannat, jotka tuottavat muunneltua tai typistettyä EPS:ää, laukaisevat kasvien puolustusreaktioita, mikä johtaa infektion estymiseen (Kelly ym., 2013).

EPS:n tuottaminen on yleistä rhizobiobakteereissa, ja eri lajien tuottaman EPS:n koostumus vaihtelee suuresti (Skorupska ym., 2006). Useissa tutkimuksissa on esitetty EPS:n rakenteiden osuutta infektiospesifisyyden määrittämisessä (Hotter ja Scott, 1991; Kannenberg ym., 1992; Parniske ym., 1994; Kelly ym., 2013). Äskettäin L. japonicus -lajissa on tunnistettu EPS-reseptori (EPR3), joka on solupinnalle lokalisoitunut proteiini, joka sisältää kolme solunulkoista LysM-domeenia ja solunsisäisen kinaasidomeenin (Kawaharada ym., 2015). EPR3 sitoo rhizobiaalista EPS:ää rakenteellisesti spesifisellä tavalla. Mielenkiintoista on, että Epr3-geenin ilmentyminen on riippuvainen Nod-tekijän signaloinnista, mikä viittaa siihen, että bakteerien pääsyä isäntäkasviin kontrolloidaan kahdella peräkkäisellä vaiheella, jotka ovat reseptorivälitteinen Nod-tekijän ja EPS-signaalien tunnistaminen (Kawaharada ym., 2015, 2017). Reseptorin ja ligandin vuorovaikutus tukee käsitystä, että EPS-tunnistuksella on rooli symbioosin spesifisyyden säätelyssä. Luonnollista vaihtelua isäntäalueen spesifisyydessä, joka johtuu isäntäreseptorien ja kantaspesifisen EPS:n välisestä spesifisestä tunnistamisesta, ei ole kuitenkaan osoitettu yhdessäkään palkokasvi-ritsobio-vuorovaikutuksessa. On huomionarvoista, että bakteeripatogeenien happamat EPS:t edistävät myös infektiota ja aiheuttavat kasvitauteja (Newman et al., 1994; Yu et al., 1999; Aslam et al., 2008; Beattie, 2011). Siten myös isännän immuunireseptorit saattavat tunnistaa rhizobiaalisen EPS:n indusoidakseen puolustusreaktioita, jotka säätelevät symbioosin kehitystä negatiivisesti.

Isännän sisäisen immuniteetin välittämä spesifisyys

Symbioottiset ja patogeeniset bakteerit tuottavat usein samankaltaisia signalointimolekyylejä helpottaakseen invaasiotaan isäntäkasvattamoon (Deakin ja Broughton, 2009). Näihin molekyyleihin kuuluvat konservoidut mikrobiin assosioituneet molekyylimallit (microbe-associated molecular patterns, MAMPs) ja erittyvät efektorit (D’Haeze ja Holsters, 2004; Fauvart ja Michiels, 2008; Deakin ja Broughton, 2009; Soto ym., 2009; Downie, 2010; Wang ym., 2012; Okazaki ym., 2013). Isäntä on kehittänyt tunnistusmekanismeja erottaakseen patogeenit ja symbiontit toisistaan ja reagoidakseen niihin eri tavoin (Bozsoki ym., 2017; Zipfel ja Oldroyd, 2017). Tämä erottelu ei kuitenkaan aina onnistu, minkä seurauksena tunnistuspesifisyyttä esiintyy usein sekä patogeenisissä että symbioottisissa vuorovaikutuksissa. Palkokasvi-ritsobio-vuorovaikutuksessa isännän reseptorien välittämällä efektorin tai MAMP:n laukaisemalla kasvin immuniteetilla on myös tärkeä rooli ritsobioiden isäntävalikoiman säätelyssä (Yang ym., 2010; Wang ym., 2012; Faruque ym., 2015; Kawaharada ym, 2015; Tang et al., 2016).

Soijapavussa on kloonattu useita dominoivia geenejä (esim. Rj2, Rfg1 ja Rj4), jotka rajoittavat tiettyjen rhizobiobikantojen nodulaatiota (Yang et al., 2010; Tang et al., 2016; Fan et al., 2017). Näissä tapauksissa nodulaation rajoittamista kontrolloidaan samalla tavalla kuin ”geeni geeniä vastaan” -resistenssiä kasvipatogeenejä vastaan. Rj2 ja Rfg1 ovat alleelisia geenejä, jotka koodaavat tyypillistä TIR-NBS-LRR-resistenssiproteiinia, joka antaa resistenssin useille B. japonicum- ja Sinorhizobium fredii -kannoille (Yang ym., 2010; Fan ym., 2017). Rj4 koodaa taumatiinin kaltaista puolustukseen liittyvää proteiinia, joka rajoittaa tiettyjen B. elkanii -kantojen nodulaatiota (Tang et al., 2016). Näiden geenien toiminta on riippuvainen bakteerin tyypin III eritysjärjestelmästä ja sen erittämistä efektoreista (Krishnan ym., 2003; Okazaki ym., 2009; Yang ym., 2010; Tsukui ym., 2013; Tsurumaru ym., 2015; Tang ym., 2016; Yasuda ym., 2016). Nämä tutkimukset viittaavat efektoreiden laukaiseman immuniteetin tärkeään rooliin nodulaation spesifisyyden säätelyssä soijapavussa. Kuten aiemmin on käsitelty, rhizobioiden Nod-tekijöillä ja pinnan polysakkarideilla voi olla merkitystä puolustusreaktioiden tukahduttamisessa (Shaw ja Long, 2003; D’Haeze ja Holsters, 2004; Tellström ym., 2007; Jones ym., 2008; Liang ym., 2013; Cao ym, 2017), mutta nämä signalointitapahtumat eivät ilmeisesti ole riittävän voimakkaita kiertämään efektoreiden laukaisemaa immuniteettia yhteensopimattomissa vuorovaikutustilanteissa.

Monet rhizobiobakteerit käyttävät tyypin III eritysjärjestelmää toimittaakseen efektoreja isäntäsoluihin infektion edistämiseksi, ja tietyissä tilanteissa toimitettua efektoria (tai toimitettuja efektoreja) tarvitaan Nod-faktorista riippumattomaan nodulaatioon, kuten on osoitettu soijapavun ja B. elkanii:n symbioosissa (Deakin ja Broughton, 2009; Okazaki et al., 2013, 2016). Toisaalta kuitenkin efektoreiden tunnistaminen isännän resistenssigeenien toimesta laukaisee immuunivasteet, jotka rajoittavat rhizobiainfektiota. Nodulaatioresistenssigeenejä esiintyy usein luonnollisissa populaatioissa, mikä herättää kysymyksen, miksi isäntä kehittyy ja ylläpitää tällaisia näennäisesti epäedullisia alleeleja. Tämä voi tapahtua tasapainottavan valinnan vuoksi, sillä samat alleelit voivat myös edistää taudinkestävyyttä taudinaiheuttajia vastaan, kun otetaan huomioon, että jotkin rhizobiaefektorit ovat homologisia bakteeripatogeenien erittämien efektoreiden kanssa (Dai ym., 2008; Kambara ym., 2009). Vaihtoehtoisesti palkokasvi voi hyödyntää R-geenejä sulkeakseen pois nodulaation vähemmän tehokkaiden typensidontakantojen kanssa ja ollakseen valikoivasti vuorovaikutuksessa sellaisten kantojen kanssa, joilla on korkea typensidontatehokkuus, kuten soijapavun Rj4-alleelilla.

M. truncatulassa tunnistettiin myös yksittäinen dominoiva lokus nimeltä NS1, joka rajoittaa nodulaatiota S. meliloti -kannan Rm41:llä (Liu et al., 2014). Toisin kuin R-geenin ohjaama isäntäspesifisyys soijapavussa, joka on riippuvainen bakteerin tyypin III eritysjärjestelmästä, Rm41-kannasta puuttuvat tällaista järjestelmää koodaavat geenit. On mielenkiintoista tietää, mikä isäntägeeni tai mitkä isäntägeenit kontrolloivat tätä spesifisyyttä ja mitä bakteerisignaaleja siihen liittyy.

Spesifisyys typen kiinnittymisessä

Symbioottinen spesifisyys ei rajoitu varhaisiin tunnistamisvaiheisiin; yhteensopimattomat isäntä-kanta-yhdistelmät voivat johtaa typen kiinnittymisessä (Fix-) puutteellisten kyhmyjen muodostumiseen. Esimerkiksi Medicago-kantojen ydinkokoelman seulonta, jossa käytettiin useita S. meliloti -kantoja, osoitti, että ∼40 % kasvi-kanta-yhdistelmistä tuotti kyhmyjä mutta ei sitonut typpeä (Liu ym., 2014). Fix- fenotyyppi ei johtunut infektion puutteesta, vaan se johtui bakteerien hajoamisesta erilaistumisen jälkeen (Yang ym., 2017; Wang ym., 2017, 2018).

Typen kiinnityspesifisyyden isäntägeeninen kontrolli on Medicago-Sinorhizobium-symbioosissa hyvin monimutkaista, ja siihen liittyy useita toisiinsa kytkeytyneitä lokuksia, joilla on monimutkaisia epistaattisia ja alleelisia vuorovaikutuksia. Käyttämällä rekombinaation sisäsiitoslinjapopulaatiosta tunnistettuja jäljellä olevia heterotsygoottisia linjoja Zhu ja kollegat pystyivät kloonaamaan kaksi taustalla olevaa geeniä, nimittäin NFS1:n ja NFS2:n, jotka säätelevät kantaspesifistä typen sidontaa koskien S. meliloti -kantoja Rm41 ja A145 (Wang et al., 2017, 2018; Yang et al., 2017). NFS1 ja NFS2 koodaavat molemmat nodulusspesifisiä kysteiinirikkaita (NCR) peptidejä (Mergaert ym., 2003). NFS1- ja NFS2-peptidit toimivat niin, että ne aiheuttavat bakteerisolukuolemaa ja varhaista kyhmyn vanhenemista alleelispesifisesti ja rhizobikantakohtaisesti, ja niiden toiminta on riippuvainen isännän geneettisestä taustasta. NCR:t on aiemmin osoitettu symbioottisen kehityksen positiivisiksi säätelijöiksi, jotka ovat välttämättömiä bakteerien terminaaliselle erilaistumiselle ja bakteerien selviytymisen ylläpitämiselle kyhmysoluissa (Van de Velde ym., 2010; Wang ym., 2010; Horváth ym., 2015; Kim ym., 2015). NFS1:n ja NFS2:n löytyminen paljasti NCR:ien negatiivisen roolin symbioottisen pysyvyyden säätelyssä ja osoitti, että NCR:t ovat isännän määrittäviä tekijöitä symbioottisen spesifisyyden suhteen M. truncatulassa ja mahdollisesti myös lähisukuisissa palkokasveissa, jotka altistavat symbioottiset bakteerinsa terminaaliselle erilaistumiselle.

M. truncatulan ja lähisukulaisten galegoidisten palkokasvien genomit sisältävät suuren määrän NCR:iä koodaavia geenejä, jotka ekspressoituvat yksinomaan infektoituneissa kyhmyruumusoluissa (Montiel et al., 2017). Näillä NCR-geeneillä, jotka muistuttavat bakteerien tyypin III efektoreita tai MAMP-geenejä, voi olla sekä positiivisia että negatiivisia rooleja symbioottisessa kehityksessä, ja molemmat roolit liittyvät peptidien antimikrobiseen ominaisuuteen. Toisaalta isäntä käyttää tätä antimikrobista strategiaa edistääkseen terminaalibakteerien erilaistumista typen sidonnan tehokkuuden lisäämiseksi (Oono ja Denison, 2010; Oono et al., 2010; Van de Velde et al., 2010; Wang et al., 2010). Toisaalta jotkin rhizobiaalikannat eivät selviä tiettyjen peptidien isoformien antibakteerisesta aktiivisuudesta. Tiettyjen bakteerikantojen haavoittuvuus vasteena peptidille riippuu bakteerin geneettisestä rakenteesta sekä isännän geneettisestä taustasta. On ehdotettu, että tämä isäntäkannan sopeutuminen ajaa molempien symbioosikumppaneiden yhteisevoluutiota, mikä johtaa NCR-geenien nopeaan moninkertaistumiseen ja monipuolistumiseen galegoidisissa palkokasveissa (Wang ym., 2017; Yang ym., 2017).

Host-alueen spesifisyys kyvyssä sitoa typpeä on dokumentoitu myös palkokasveissa (esim. soijapavut), joissa bakteerit käyvät läpi reversiibeliä eriytymistä. Soijapavussa tämäntyyppinen yhteensopimattomuus liittyi fytoalexiinin kertymisen induktioon ja yliherkkyysreaktioon kyhmysoluissa (Parniske ym., 1990). Soijapavun genomissa ei ole NCR-geenejä, mikä viittaa uusien geneettisten mekanismien osallistumiseen, jotka säätelevät tätä spesifisyyttä. Laboratoriossamme tehdään parhaillaan työtä asiaan liittyvien isäntägeenien tunnistamiseksi.

Johtopäätökset ja tulevaisuuden näkymät

Palkokasvi-ritsobiosymbioosin spesifisyys johtuu kahden symbioosikumppanin välisestä signaalien vaihdosta (yhteenveto kuvassa 1). Viimeaikaiset tutkimukset ovat vasta alkaneet paljastaa tätä spesifisyyttä sääteleviä molekyylimekanismeja, ja monet haastavat kysymykset odottavat vastausta. Effektorin laukaiseman immuniteetin on osoitettu olevan tärkeä tekijä määriteltäessä rhizobioiden isäntävalikoimaa soijapavussa, mutta siihen liittyviä efektoreita ei ole määritelty selkeästi. Mitkä geenit säätelevät nodulaation spesifisyyttä Medicago-Sinorhizobium-vuorovaikutuksessa, jossa bakteerikumppanilta puuttuu tyypin III eritysjärjestelmä? NS1-lokuksen kloonaaminen ja karakterisointi M. truncatulassa (Liu et al., 2014) antaa uutta tietoa tästä kysymyksestä. Tiedämme nyt, että NCR-peptidit säätelevät typensidontaspesifisyyttä Medicagossa ja mahdollisesti muissa läheisesti sukua olevissa palkokasveissa, mutta meiltä puuttuu mekaaninen ymmärrys siitä, miten nämä peptidit toimivat. Ovatko pro- ja antisymbioottiset peptidit vuorovaikutuksessa samojen bakteerikohteiden kanssa? Miten aminohappojen substituutiot vaikuttavat peptidin rakenteeseen ja toimintaan? Miten typen sidonnan spesifisyyttä säädellään NCR:ää vailla olevissa palkokasveissa, kuten soijapavussa, jossa bakteerit erilaistuvat palautuvasti? Nämä ovat vain kourallinen avoimia kysymyksiä, jotka on ratkaistava. Näihin kysymyksiin vastaaminen varmasti rikastuttaa tietämystämme siitä, miten spesifisyyttä kontrolloidaan, ja antaa meille mahdollisuuden käyttää tätä tietoa kehittääksemme välineitä symbioottisen typensidonnan geneettiseen parantamiseen palkokasveissa.

KUVIO 1

KUVIO 1. Spesifisyyden säätely. Symbioosin signalointi ja kasvin immuniteetti, jotka osallistuvat tunnistuspesifisyyteen palkokasvien ja ritsobiobien vuorovaikutuksessa (merkitty punaisilla tähdillä). (A) Infektioprosessi ja kyhmyjen kehitys. Kypsässä epämääräisessä kyhmyssä on meristemivyöhyke (I), infektiovyöhyke (II), välivyöhyke (IZ), typensidontavyöhyke (III) ja vanhenemisvyöhyke (IV). (B) Isäntä erittää flavonoideja indusoidakseen bakteerin nodulaatio-geenin (nod) ilmentymisen NodD-proteiinien aktivoinnin kautta. Nod-geenien koodaamat entsyymit johtavat Nod-tekijöiden (NF) synteesiin, jotka isännän Nod-tekijäreseptorit (NFR) tunnistavat. Tunnistusspesifisyyttä esiintyy sekä flavonoidien ja NodD:iden että NF:ien ja NFR:ien välillä. (C) NF-signaloinnin lisäksi bakteerit tuottavat solunulkoisia polysakkarideja (EPS) ja tyypin III efektoreja helpottaakseen infektiotaan yhteensopivissa vuorovaikutustilanteissa, mutta nämä molekyylit voivat myös indusoida immuunivasteet, jotka aiheuttavat infektioresistenssiä yhteensopimattomissa vuorovaikutustilanteissa. (D) Tietyt palkokasvit, kuten Medicago, koodaavat antimikrobisia nodulaspesifisiä kysteiinirikkaita (NCR) peptidejä, jotka ohjaavat bakteerikumppaneitaan typen sitomiseen tarvittavaan terminaaliseen erilaistumiseen. Jotkin rhizobiaalikannat eivät kuitenkaan selviä tiettyjen peptidien isoformien antibakteerisesta aktiivisuudesta, mikä johtaa typen sidontaan puutteellisesti kykenevien kyhmyjen muodostumiseen.

Author Contributions

Kaikki luetellut kirjoittajat ovat antaneet merkittävän, suoran ja älyllisen panoksensa työhön ja hyväksyneet sen julkaistavaksi.

Rahoitus

Tätä työtä ovat tukeneet United States Department of Agriculture/National Institute of Food and Agriculture, Agriculture and Food Research Initiative Grant 2014-67013-21573, Kentucky Science and Engineering Foundation Grant 2615-RDE-015 ja Kentucky Soybean Promotion Board.

Conflict of Interest Statement

Tekijät ilmoittavat, että tutkimus tehtiin ilman kaupallisia tai taloudellisia suhteita, jotka voitaisiin tulkita mahdolliseksi eturistiriidaksi.

Aslam, S. N., Newman, M. A., Erbs, G., Morrissey, K. L., Chinchilla, D., Boller, T., et al. (2008). Bakteerien polysakkaridit tukahduttavat indusoitua synnynnäistä immuniteettia kalsiumkelaation avulla. Curr. Biol. 18, 1078-1083. doi: 10.1016/j.cub.2008.06.061