Abstract
Glykogeenifosforylaasi on tärkeä entsyymi lihaksen hiilihydraattiaineenvaihdunnassa. Se käyttää epäorgaanista fosfaattia glukoosin poistamiseen glykogeenista, jolloin syntyy glukoosi-1-fosfaattia, jota voidaan käyttää ATP:n tuotantoon. Inaktiivinen glykogeenifosforylaasi (fosforylaasi h) aktivoituu joko 5′-AMP:n allosterisella sitoutumisella tai fosforylaasikinaasin (PhK) fosforyloimalla. Fosforylaatio tuottaa fosforylaasi a:n, joka on aktiivinen ilman AMP:tä. PhK on ainoa kinaasi, joka voi fosforyloida fosforylaasi b:tä, joka puolestaan on PhK:n ainoa substraatti. Tässä väitöskirjatutkimuksessa on pyritty selvittämään syitä tähän spesifisyyteen ja siihen, miten nämä kaksi entsyymiä tunnistavat toisensa, tutkimalla glykogeenifosforylaasin paikkaohjattuja mutaatioita;Kaikista mutaatioista tutkittiin, muuttuuko niiden vuorovaikutus fosforylaasikinaasin katalyyttisen alayksikön typistetyn muodon, gamma(1–300), kanssa. Kolme mutaatiota (R69K, R69E ja E501A), jotka tehtiin joko fosforylaasi b:n tai a:n aminoterminaalin kanssa vuorovaikutuksessa oleviin kohtiin, eivät juurikaan eronneet gamma(1–300):n suorittamassa fosforylaatiossa verrattuna fosforylaasi b:hen. Viisi mutaatiota, jotka tehtiin kolmeen paikkaan fosforylaasin aminoterminaalisessa hännässä (K11A, K11E, I13G, R16A ja R16E), aiheuttivat kuitenkin gamma(1–300):n katalyyttisen tehokkuuden vähenemisen verrattuna fosforylaasi b:hen. R16E oli huonoin substraatti gamma(1–300):lle, sillä sen katalyyttinen tehokkuus laski 47-kertaisesti. Aminoterminaali ja erityisesti Arg 16 ovat erittäin tärkeitä tekijöitä gamma(1–300)-fosforylaasin tunnistamisessa. Lisäksi proteiinikinaasi A, joka ei tunnista natiivia fosforylaasia, pystyi fosforyloimaan I13G:n ja R16A:n. Joillakin mutanteilla havaittiin myös muuttuneita konformaatiotiloja. R16A ja R16E aktivoituivat hyvin alhaisessa AMP-pitoisuudessa ja kiteytyivät alhaisessa lämpötilassa, kuten fosforylaasi a. Tämä osoittaa, että jopa ilman fosforylaatiota niiden rakenteet muistuttavat enemmän fosforylaasi a:ta kuin fosforylaasi b:tä. Kaksi muuta mutanttia sai aikaan päinvastaisen vaikutuksen, ne käyttäytyivät fosforylaasi b:n tavoin fosforylaation jälkeen. R69E aktivoitui vain osittain fosforylaation seurauksena, ja I13G oli täysin inaktiivinen fosforylaation jälkeen. I13G oli ensimmäinen havainto fosforylaasimuodosta, jota ei voitu aktivoida fosforylaatiolla.