Kineettisesti rajoitettu differentiaalinen sentrifugointi edullisena ja helposti saatavilla olevana vaihtoehtona sentrifugaaliselle eluoinnille

Monissa sovelluksissa halutaan erottaa kohdesoluja seoksista, jotka sisältävät muita soluja, joilla on samankaltainen tiheys, mutta jotka eroavat kooltaan toisistaan (joko hieman tai merkittävästi). Esimerkkeinä voidaan mainita synkronoitujen soluviljelmien tuottaminen, jossa eristetään soluja niiden syklin tietyssä vaiheessa (jolle on ominaista niiden koko) (1-2), kortikotrooppien eristäminen muista aivolisäkesoluista (3) ja monosyyttien eri osapopulaatioiden lajittelu (4). Suositeltava menetelmä solupopulaatioiden erottamiseen sedimentaationopeuden erojen perusteella (erityisesti silloin, kun tiheyserot eivät ole merkittäviä) on prosessi, jota kutsutaan sentrifugaaliseksi elutrioimiseksi (5). Tällöin erottelukappaleisiin (yleensä soluihin) kohdistuu kaksi voimaa: (i) keskipakovoima, joka saa ne sedimentoitumaan nopeudella, joka on niiden tiheyden ja koon funktio, ja ii) vastakkaissuuntainen konvektiivinen virtaus, joka antaa kaikille soluille kiinteän nopeuden. Virtausta ja/tai sentrifugointinopeutta voidaan säätää siten, että kerätään vain ne solut, joiden sedimentoitumisnopeus on tietyllä alueella. Vaikka tätä prosessia on käytetty menestyksekkäästi myös bakteerisolujen erottamiseen matriiseista, joissa niitä esiintyy (6) (kiinnostava sovelluksemme), erikoislaitteiden tarve on esteenä monille laboratorioille.

Vaikka on kuvattu useita protokollia bakteerien eristämiseksi erilaisista matriiseista, kuten elintarvikkeista (7-8), maaperästä (9) ja mikrobimatoista (10), joissa hyödynnetään helposti saatavilla olevia pöytäsentrifugeja solujen erottamiseksi toisistaan erilaisten sedimentaationopeuksien perusteella, suositellut protokollat näyttävät usein olevan tapauskohtaisia. Esimerkiksi Wang et al. (8) suosittelivat sentrifugointia <1000×g:ssä määrittelemättömän ajan roskien poistamiseksi, kun bakteereja eristetään pehmeästä juustosta, ja sen jälkeen sentrifugointia 9000×g:ssä 3 minuutin ajan bakteerien keräämiseksi. Vastaavasti bakteerien eristämiseksi homogenoidusta lihasta Neiderhauser et al. (7) suosittelivat sentrifugointia 100×g:ssä (määrittelemättömän ajan) ruokahiukkasten poistamiseksi ja sen jälkeen sentrifugointia 3000×g:ssä (jälleen määrittelemättömän ajan) bakteerien keräämiseksi. Muissa tapauksissa suositellut protokollat sisältävät useita sentrifugointikierroksia. Esimerkiksi mikrobimattojen bakteerien eristämiseksi Bey ja muut (10) suosittelevat sentrifugoinnin lisäksi sentrifugointia 500 × g:ssa 15 minuutin ajan sekä sedimentin uudelleen suspendoimista ja menettelyn toistamista neljä kertaa. Vastaavasti Bakken (9) suosittelee bakteerien eristämiseksi maaperästä näytteen homogenoidun näytteen toistuvaa sentrifugointia (”useita kertoja”) 630-1060×g:n sentrifugointikierroksella (tarkemmin määrittelemättömän ajan), minkä jälkeen näyte suspendoidaan uudelleen ja homogenoidaan uudelleen. Samanlaisia menetelmiä on ehdotettu myös bakteerien eristämiseksi ”positiivisesta” veriviljelyliemestä. Saadakseen puhtaita bakteerieristeitä ennen niiden identiteetin määrittämistä MALDI-TOF-massaspektrometrillä Stevenson ym. (11) käyttivät monivaiheista sentrifugointimenetelmää, johon sisältyi peräkkäisiä sentrifugointivaiheita ”1-2 minuuttia” 8500, 1000 ja 13 000 RPM:n kierrosluvuilla (arvoa g:nä ei ole täsmennetty) ja jossa pellettiä suspensioitiin uudelleen erilaisiin puskureihin jokaisessa vaiheessa.

Nämä mainitut protokollat eivät suinkaan ole ainoita esimerkkejä ad hoc -sentrifugointiprotokollista, joille on ominaista sentrifugointinopeuksien ja/tai -aikojen ilmeisen mielivaltainen valinta. Tällaisten ad hoc -protokollien tärkeä seuraus on, että ne eivät tarjoa mitään rationaalista pohjaa, jonka avulla muut voisivat kehittää protokollia erilaisten kohdesolujen eristämiseksi muista matriiseista/soluseoksista. On esimerkiksi intuitiivisesti ilmeistä, että pitkäkestoinen sentrifugointi johtaa siihen, että kaikki hiukkaset laskeutuvat, kun taas lyhytaikainen sentrifugointi laskeuttaa vain nopeimmat hiukkaset ja useimmat hitaammat hiukkaset jäävät suspensioon. Optimaalisen nopeuden/keston määrittäminen sentrifugointia varten, jotta kohdehiukkanen saadaan eristettyä ja muut hiukkaset poistettua, on kuitenkin enemmänkin taidetta. Toisin sanoen, tällä hetkellä raportoidut protokollat eivät tarjoa rationaalista pohjaa muutoksille (optimaalisten sentrifugointinopeuksien/-aikojen määrittäminen) muiden vastaavien erottelu-/eristämistavoitteiden osalta.

Materiaalit ja menetelmät

Teoria

Kuvassa 1 on esitetty ehdottamamme menetelmä, jonka avulla voidaan erottaa toisistaan kahta hiukkastyyppiä, joilla on samankaltainen tiheys mutta erilaiset sedimentaationopeudet kokoeroista johtuen. Prosessin alussa (kuva 1(1)) suspensio (meidän tapauksessamme veriviljelyliemi), joka sisältää separantteja (valkosoluja eli WBC:tä, punasoluja eli RBC:tä, verihiutaleita ja bakteereja), ladataan erillisenä kerroksena kirkkaan tiheän puskurikerroksen (meidän tapauksessamme Histopaque 1083) päälle. Puskurin tiheys on suurempi kuin valkosolujen (ρ = 1,06-1,08 g/ml (12)) ja verihiutaleiden (ρ = 1,05-1,07 g/ml (13)), mutta pienempi kuin punasolujen (ρ = 1,1 g/ml (14)) ja bakteerien (ρ = 1,105 g/ml Escherichia coli -bakteerin (15)). Sentrifugoinnin edetessä kaikki hiukkaset ajautuvat alaspäin, ensin ylimmän kerroksen (veriviljelymedia) läpi ja sitten tiheään puskuriin (Histopaque). Hiukkaset, joiden tiheys on suurempi kuin puskurin tiheys (RBC:t ja bakteerit) laskeutuvat sekä veriviljelyliemen että tiheän puskurin läpi, mutta vähemmän tiheät separaatiot (WBC:t ja verihiutaleet) jäävät jälkimmäisen ulkopuolelle. Tämä prosessi on samanlainen kuin protokolla, jota suositellaan WBC:iden ja verihiutaleiden erottamiseksi kokoverestä (16). Meidän tarkoitukseemme tämä prosessi ei kuitenkaan yksinään riitä, koska vaikka joitakin ei-toivottuja hiukkasia (WBC:t ja verihiutaleet) erotetaan kohdehiukkasista (bakteerit) tiheyserojen perusteella, jäljelle jää muita hiukkasia, joilla on samanlainen tiheys (RBC:t). Jotta saavuttaisimme tavoitteemme kerätä kaikki kohdesolut (bakteerit) ja poistaa samalla kaikki jäljelle jäävät ei-toivotut hiukkaset (RBC:t), ehdotamme, että järjestelmä viedään kuvassa 1(4) esitettyyn tilaan ja pysäytetään sentrifugointiprosessi siihen. Tässä tilassa kaikki RBC-solut, joilla on suuremman kokonsa vuoksi suurempi laskeutumisnopeus, laskeutuvat putken pohjalle pelletiksi, kun taas kaikki bakteerisolut dispergoituvat tiheään puskuriin.

Tämän halutun tilan saavuttamiseksi on kuitenkin täytettävä useita rajoituksia. Ensinnäkin, jotta varmistetaan, että kaikki bakteerit kerääntyvät puskuriin, meidän on annettava yläosasta (taso A) alkaneille bakteereille riittävästi aikaa siirtyä veriviljelyliemikerroksen (Medium 1) läpi Histopaqueen (Medium 2). Matemaattisesti tämä tarkoittaa, että:

missä t on aika, jonka ajan sentrifugointiprosessi suoritetaan, l1 on ladatun veriviljelyliemipatsaan pituus ja vb1 on bakteerien sedimentaationopeus tässä kerroksessa. Tämä ajankohta (jolloin tasolta A lähtevät bakteerit ovat juuri ylittäneet tason B ja päässeet puskuriin) on esitetty kuvassa 1(2).

Tämän tilan toinen merkittävä piirre on se, että bakteerit ja punasolujen solut eivät välttämättä ole muodostaneet erillisiä ”kaistoja” puskurissa tähän mennessä. Vaikka RBC:t, jotka lähtevät liikkeelle mistä tahansa vaakatasosta, vaeltavat kauemmas kuin samalla tavalla sijaitsevat bakteerit, RBC:t, jotka ovat lähteneet liikkeelle tasolta A, eivät välttämättä ole ohittaneet bakteereja, jotka ovat lähteneet liikkeelle tasolta B (kahden nesteen välinen rajapinta). Jotta näin tapahtuisi ja RBC:t ja bakteerit muodostaisivat erillisiä kaistoja puskurissa, puskurikolonnin on oltava riittävän pitkä. Erillisten kaistaleiden muodostuminen ei ole mahdollista, jos puskuripylväs ulottuu esimerkiksi vain niin syvälle kuin kuvassa 1(2) katkoviivalla osoitettu taso. Matemaattisesti ehto, jonka mukaan tasolta A alkavat punasolut (nopeammin laskeutuvat hiukkaset) ohittavat tasolta B alkavat bakteerit (hitaammin laskeutuvat hiukkaset), voidaan ilmaista seuraavasti:

missä l1 ja l2 ovat veriviljelyliemen (väliaine 1) ja puskurin (väliaine 2) pylväiden pituudet; vR1 ja vR2 ovat RBC:iden laskeutumisnopeus liemessä ja vR2 puskurissa; ja vb2 on bakteerien laskeutumisnopeus puskurissa. Yllä oleva yhtälö voidaan järjestää uudelleen siten, että saadaan:

Lisäksi olisi suotavaa, että kaikki alun perin Medium 1:ssä olevat bakteerit kerättäisiin Medium 2:een. Tämä tarkoittaa, että siihen mennessä, kun ylhäältä (taso A) alkavat bakteerit ylittävät kahden faasin välisen rajapinnan (taso B), tasolta B alkavat bakteerit eivät saa olla ehtineet alhaalle. Matemaattisesti tämä ehto ilmaistaan seuraavasti:

jossa vb1 on Medium 1:n bakteerien sedimentaationopeus. Edellä oleva voidaan järjestää uudelleen niin, että saadaan:

Jos yhtälöt (3) ja (5) täyttyvät, systeemi saavuttaa kuvassa 1(4) esitetyn tilan, jossa kaikki RBC:t ovat saavuttaneet putken pohjan ja muodostavat erillisen kerroksen, mutta yksikään bakteeri ei ole tehnyt niin. (Ne ovat kaikki väliaineessa 2). Tämä tila syntyy ensimmäisen kerran, kun kaikki RBC:t (myös ne, jotka aloittavat tasolta A) ovat saavuttaneet putken pohjan. Matemaattisesti tuo ajanhetki (t1) voidaan esittää seuraavasti:

Tila lakkaa olemasta, kun bakteerit (ne, jotka alun perin olivat rajapinnassa eli tasossa B) alkavat päästä putken pohjalle. Aika, jolloin tämä tapahtuu (t2), saadaan:

Siten parhaan mahdollisen erottelun aikaansaamiseksi on i) varmistettava, että molempien väliaineiden pylväiden pituudet täyttävät yhtälöt (3) ja (5), ja ii) että sedimentaation kesto (tcentrifugation) saadaan:

Sentrifugoinnin jatkaminen pidempään kuin t2 johtaa kuvan 1(5) mukaiseen tilanteeseen, jossa osa tai kaikki bakteerit sedimentoituvat myös pohjalle. Jotta halutuista lajeista saataisiin puhtaita isolaatteja, sentrifugointi on lopetettava kuvan 1(4) mukaisessa vaiheessa, ylempi kerros on hylättävä ja tiheä puskuri on vedettävä pohjalla olevaa sedimenttiä häiritsemättä. Haluttaessa kohdepartikkelit voidaan sentrifugoida ja resuspensioida muihin väliaineisiin.

Tämä ”toimintaikkuna” t1:n ja t2:n välillä on esitetty kaaviomaisesti kuvassa 2. Tässä abskissa osoittaa sentrifugointiajan, kun taas ordinaatti osoittaa tiheässä puskurissa (Medium 2) olevien RBC- ja bakteerihiukkasten osuuden. Molempien osalta osuus kasvaa aluksi, kun ne vaeltavat sisään ylimmästä kerroksesta, pysyy vakiona jonkin aikaa, kun ne vaeltavat kaistoittain tiheän puskurin läpi, ja lopulta pienenee, kun ne laskeutuvat pohjaan. Nopeammin liikkuvien RBC:iden nousu- ja laskukaltevuus on jyrkempi sekä lyhyempi aika, jolloin kaikki ne ovat tiheässä puskurissa. ”Toiminta-ikkunan” (pilvinen laatikko) aikana puskurissa on käytännöllisesti katsoen kaikki bakteerit (∼ 100 %), mutta RBC:itä ei ole käytännöllisesti katsoen lainkaan (∼ 0 %).

RBC:iden ja bakteerien laskeutumisnopeudet (jotka määrittävät yhtälöiden 3,5 ja 8 mukaisten rajoitusten numeeriset arvot) voidaan ennustaa niiden muodon, koon ja tiheyden perusteella. RBC:n sedimentaationopeus saadaan (17) yhtälöllä:

jossa ρ ja ρl ovat hiukkasen ja nesteen tiheydet, µ on nesteen viskositeetti, R on hiukkasen tehollinen säde ja g on painovoiman/sentrifugoinnin aiheuttama kiihtyvyys. E. coli on sauvamainen bakteeri, joka on 2 mikronin pituinen ja halkaisijaltaan 0,5 mikronia (18). Näin ollen voimme mallintaa niitä prolate-sferoideina, joiden efektiivinen sedimentaatiosäde (R) saadaan (19) kaavalla:

jossa a, ja b ovat pää- ja sivuakselin puolipituudet. Näin ollen E. colin tapauksessa a = 1 mikroni ja b = 0,25 mikronia. Näiden arvojen perusteella odotamme, että E. colin sedimentaationopeus on 26,7 mikronia sekunnissa ylemmän nesteen läpi ja 6,56 mikronia sekunnissa Histopaque 1083.

Toisaalta ihmisen RBC:t ovat kaksoiskuperia kiekkoja, joiden halkaisija on 7-8 mikronia ja paksuus 2 mikronia (20). Ne voidaan näin ollen mallintaa oblate-sferoideiksi, joiden efektiivinen sedimentaatiosäde saadaan (19) seuraavalla kaavalla:

joissa a ja b ovat vastaavasti pää- ja sivuakselin puolipituudet. Kun a:n arvot ovat 4 mikronia ja b:n arvot 1 mikroni, ennustamme, että kun punasoluja sentrifugoidaan laitteellamme, Eppendorf-5804:llä, suhteellisella sentrifugivoimalla 400 × g, ne sedimentoituvat nopeudella 500 mikronia sekunnissa ylimmän kerroksen läpi, jonka tiheys on ∼1.02 g/ml (mittauksemme mukaan) ja 101 mikronia/sekunti Histopaquen (tiheys = 1,083 g/ml) läpi.

Hiukkasten laskeutumisnopeus voidaan ennustaa tarkemmin ottamalla huomioon hiukkasten ja hiukkasten vuorovaikutukset. Nämä hiukkas-hiukkas-vuorovaikutukset syntyvät, kun laskeutuvan hiukkasen ylöspäin syrjäyttämä neste törmää muihin hiukkasiin, jotka ovat välittömästi ensimmäisen hiukkasen takana tai vieressä, jolloin jälkimmäisiin kohdistuu lisääntynyt nesteen vetovoima ja siten pienennetään hiukkasryhmän tehokasta (keskimääräistä) laskeutumisnopeutta. Tätä ilmiötä kutsutaan ”estetyksi laskeutumiseksi”, ja se on otettava huomioon, kun hiukkasten tilavuusosuus ei ole häviävän pieni. Käytettävissä on useita puolianalyyttisiä tai empiirisiä lausekkeita tehokkaiden laskeutumisnopeuksien laskemiseksi järjestelmille, joissa on estynyt laskeutuminen (21). Yksi tällainen lähestymistapa on Richardson-Zakin korrelaatio, jossa efektiivinen laskeutumisnopeus (v′) saadaan seuraavasti:

jossa v on hiukkasen laskeutumisnopeus esteettömässä tapauksessa ja φ on hiukkasten tilavuusosuus. Veri laimennetaan yleensä veriviljelyliemeen laimennoksella 1:4 (22). Koska hematokriitti (veressä olevien punasolujen tilavuusosuus) on tyypillisesti noin 0,4-0,45 (23), näytteessämme olevien punasolujen tilavuusosuus on noin 0,1. Jos tämä otetaan huomioon yhtälön 12 avulla, RBC:iden ennustettu laskeutumisnopeus väliaineissa 1 ja 2 on 307 mikronia sekunnissa ja 62 mikronia sekunnissa. Kun veriviljelyt muuttuvat positiivisiksi, ne sisältävät ∼108 CFU (colony forming units) (soluja) bakteereita millilitrassa suspensiota (24). Niiden pienen koon (säde ∼1 mikronia) vuoksi niiden tilavuusosuus jää kuitenkin alle 0,001:n, ja ”haittaavan laskeutumisen” vaikutus voidaan jättää huomiotta.

Kun on annettu näytetilavuus, josta halutaan eristää kiinnostava solutyyppi (kiinnostavat solutyypit), lisämateriaaleissa olevaa vuokaaviota (lisäkuva 1) voidaan käyttää ohjaamaan sedimentointipuskurin valintaa, ennustamaan kiinnostavien solujen sedimentaationopeudet kyseisessä puskurissa, määrittämään sopiva tilavuus (pylvään pituus käytettävissä olevassa sentrifugointiputkessa) ja lopulta laskemaan optimaalinen sentrifugoinnin kestoajan pituus (toiminta-aikaikkuna) käytettävissä olevalla (käytettävissä olevalla) sentrifugilla (käytettävissä olevalla (käytettävissä olevilla) sentrifugilla. Meidän järjestelmäämme varten (5 ml ”positiivista” veriviljelylientä ladattuna 15 ml:n sentrifugiputkiin) prosessi on tiivistetty taulukkoon 1.

Taulukko 1. Prosessin kulku. Teoreettiset ennusteet kolonnin vähimmäispituuksista ja vähimmäis- ja enimmäiskäyttöajoista.

Kokeellinen validointi

Valmistimme ensin synteettisen ”positiivisen veriviljelyliemen” dispergoimalla 8 ml:aan BACTEC Ped-Plus -liemialustaa (Becton Dickinson, Sparks, MD) 2 ml tuoretta verta (joka oli otettu vapaaehtoiselta henkilöltä) ja 0,0 milj.1 ml suspensiota, joka sisältää ∼104 CFU:ta (soluja) millilitrassa E. coli K-12:ta, ja inkuboidaan seosta sekoittajalla 37 °C:n lämpötilassa yön yli (12-14 h), jotta saadaan suspensio, joka sisältää ∼109 RBC:tä/ml ja 108 CFU:ta/ml bakteereita. 1,5 ml lientä otettiin mikrosentrifugiputkeen (Eppendorf, New York, USA) ja solut ”pellettoitiin” pois sentrifugoimalla. Supernatantti otettiin pois ja 1 ml:n massa mitattiin vaa’alla (OHaus® GA-110) liemen nesteen tiheyden arvioimiseksi.

Lisäksi 5 ml positiivista veriviljelylientä ladottiin 5 ml:n Histopaque-1083 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO USA) päälle. Useita tällaisia putkia ladattiin Eppendorf-5804-penkkisentrifugiin ja sentrifugoitiin eri pituisia aikoja (1 min, 3 min, 6 min, 10 min, 15 min, 30 min, 50 min, 70 min ja 90 min). Sentrifugoinnin päätyttyä putki poistettiin varovasti, päällimmäinen kerros (veriviljelyliemi) heitettiin pois ja Histopaque-kerros otettiin talteen häiritsemättä pohjalla olevaa sedimenttiä (jos sitä oli). Kerätyn nesteen bakteeripitoisuus määritettiin vakiomenetelmillä, joihin kuuluivat sarjalisäyslaimennus, levitys Tryptic Soy Agariin, inkubointi ja pesäkelaskenta (25). Punasolujen pitoisuudet saatiin tutkimalla näytteen aliquot-annos hemosytometrillä mikroskoopin alla (26).

Tulokset ja keskustelu

Tulokset on esitetty tiivistetysti kuvassa 3. Viivat edustavat verisolujen tai bakteerien teoreettista lukumäärää, jonka odotetaan olevan Histopaque-kerroksessa (miinus pohjassa oleva sedimentti) teoreettisten ennusteidemme perusteella. Kiinteät symbolit edustavat vähintään kolmen lukeman keskiarvoa havaittujen verisolujen (neliöt) ja E. coli -bakteerien (timantit) lukumääristä. Virhepalkit ovat keskihajonta.

Kuten kuviosta 3 nähdään, havaittu käyttäytyminen vastaa laadullisesti ennusteitamme; molempien tiheiden partikkeleiden (RBC:t ja bakteerit) kohdalla konsentraatiot Histopaque 1083:n kerroksessa nousevat aluksi ajan myötä, sitten ne pysyvät vakioina tietyn keston ajanjakson ajan ja lopulta vähenevät. Havaittiin kuitenkin, että RBC:n osalta koko prosessi (nousu, vakaa tila ja lasku) tapahtuu hieman ennustettua hitaammin. Tämän hieman alhaisemman laskeutumisnopeuden vaikutus ei onneksi vaikuta toimintaikkunaan, koska ikkunan alkua säätelee aika, joka tarvitaan, jotta kaikki bakteerit pääsevät tiheään puskuriin. Siihen mennessä, kun tämä tapahtuu, punasolujen pitoisuus tiheässä puskurissa on häviävän pieni. Toisin sanoen malleissamme ennustetun toimintaikkunan (∼20 min – ∼75 min) nähdään pitävän paikkansa.

Yleisimmin esiintyvät bakteerit ovat myös melko pieniä (∼1 mikronin ominaispituus) ja niiden tiheydet ovat samankaltaisia. (esim. 1,1 g/ml Pseudomonas (27); 1,13 g/ml Streptococcus (28) ja 1,135 g/ml Bacillus (29)). Näin ollen niiden sedimentaationopeudet ovat todennäköisesti verrattavissa E. coli -bakteerin sedimentaationopeuksiin sekä veriviljelyliemessä että Histopaque-1083:ssa, ja näin ollen myös toimintaikkunan pitäisi olla samanlainen. Vaikka toimintaikkunamme (∼20 min – ∼75 min) on sovellettavissa vain laitteistomme ja kokeellisten parametrien osalta, teoreettinen analyysimme tarjoaa perustan muiden toimintaikkunoiden ennustamiselle, ei ainoastaan bakteerien eristämiseksi positiivisista veriviljelyliemistä eri laitteistoja käyttäen, vaan myös muiden kohdesolujen eristämiseksi erilaisista matriiseista tiheitä puskureita käyttäen. Menetelmää voidaan käyttää myös peräkkäin kohteen eristämiseen seoksesta, joka sisältää sekä nopeammin että hitaammin laskeutuvia lajeja. Tällaisissa tapauksissa menetelmäämme käytettäisiin ensin kaikkien nopeammin liikkuvien lajien eliminoimiseen ja sen jälkeen sen avulla kerättäisiin jäljelle jäävästä seoksesta nopeimmin laskeutuva kohdelaji.

.