Klonogeeninen määritys: mitä, miksi ja miten

Klonogeeninen määritys, joka tunnetaan myös nimellä kolonioiden muodostusmääritys

on solujen eloonjäämismääritys in vitro. Sillä arvioidaan yksittäisten solujen kykyä selviytyä ja lisääntyä muodostaen pesäkkeitä.1 Tämä määritys kuvattiin ensimmäisen kerran 1950-luvulla, jolloin sitä käytettiin tutkittaessa säteilyn vaikutuksia syöpäsolujen selviytymiseen ja kasvuun, ja sillä on sittemmin ollut olennainen merkitys radiobiologiassa.2

Kloonogeenisuuden mittaamiseksi soluja on kylvettävä hyvin pienillä tiheyksillä ja jätettävä 1-3 viikon ajaksi, jotta pesäkkeitä muodostuu. Tämän jälkeen pesäkkeet kiinnitetään, värjätään kristallivioletilla niiden näkyväksi tekemiseksi ja lasketaan. Tietojen analysoimiseksi piirretään solujen eloonjäämiskäyrät. Nykyään klonogeneettisiä määrityksiä käytetään vastaamaan moniin kokeellisiin kysymyksiin, erityisesti syöpäbiologiassa.

Tässä blogissa korostetaan:

Miten klonogeeninen määritys suoritetaan ja mitä tärkeitä seikkoja on otettava huomioon matkan varrella

Merkitsemättömän mikroskopian ja konfluenssin havaitsemisen käyttäminen pesäkkeiden lukumäärän ja koon arvioimiseksi automatisoidun kuvakvantifioinnin avulla

Klonogeeninen eloonjäämismääritys

Klonogeenisia määrityksiä käytetään laajalti syöpätutkimuksen alalla, sillä kloonien muodostuminen tulkitaan syöpäsolujen ominaisuudeksi, jolla on kasvaimen käynnistämiskyky. Vaikka tätä määritystä käytettiin alun perin radiobiologian alalla, siitä on tullut syöpätutkimuksen vakioväline, jolla arvioidaan solukasvua ja erilaisten mahdollisesti kliinisesti sovellettavien aineiden sytotoksisia tai genotoksisia vaikutuksia. Näihin kuuluvat kemoterapeuttiset aineet ja kohdennetut hoidot yksinään tai yhdistelmänä 3.

Klonogeenistä kasvua käytetään myös tiettyjen solupopulaatioiden kantasoluisuuden arviointiin, sillä kantasolut ovat pitkäikäisiä soluja, joilla on potentiaalia jatkuvaan lisääntymiseen. Tämä on erityisen tärkeää syöpätutkimuksen kannalta, koska syöpäkantasolut liittyvät usein kemoresistenssiin, sekundaarikasvainten muodostumiseen ja syövän uusiutumiseen. Siksi syövän kantasolujen tutkiminen klonogeneettisellä määrityksellä on arvokas ja laajalti käytetty väline, jolla voidaan ennustaa tietyn hoidon tehoa.4

Klonogeneettisillä määrityksillä mitataan solujen kykyä säilyttää lisääntymiskykynsä pitkäaikaisesti. Tämä on tärkeä ominaisuus, koska se paljastaa fenotyyppiset vaikutukset, joiden kehittyminen vaatii aikaa ja mahdollisesti useita solunjakautumia. Tämä on erityisen tärkeää terapeuttista resistenssiä analysoitaessa. Lääkeresistenssiä ei voida tunnistaa lyhytaikaisilla sytotoksisuusmäärityksillä5.

Kloonogeenisen määrityksen suorittaminen

Tämän jakson tiedot on mukautettu Franken ym. (2006) julkaisemasta kloonogeenisen määrityksen protokollasta Nature Protocols1 -lehdessä, yhdistettynä joihinkin oivalluksiin omasta kokemuksestani, jonka olen saanut suorittaessani tohtorintutkintovaiheeni aikana yli 60:tä kloonogeenistä määritystä.

Kloonogeenisen määrityksen suorittamiseen on pohjimmiltaan kaksi erilaista tapaa:

(1) Soluja voidaan kylvää pienillä tiheyksillä ja sitten käsitellä, jotta voidaan tutkia käsittelyn vaikutusta solujen klonogeenisuuteen.

(2) Soluja voidaan käsitellä tietyn ajanjakson ajan ja istuttaa sitten uudelleen pienillä tiheyksillä käsittelystä vapaassa väliaineessa klonogeenisuuden testaamiseksi.

Viimeistä käytetään usein hoidon jälkeisen terapeuttisen resistenssin arviointiin. Kuvassa 1 esitetään yhteenveto ensimmäisestä lähestymistavasta, joka on perinteinen menetelmä klonogeenisen määrityksen suorittamiseksi. Kuten käy ilmi, tämä on aikaa vievä menetelmä, joka ei anna tietoa kokeen etenemisestä (vain päätepiste). Keskustelemme myöhemmin automatisoiduista ja muista kuin päätepistevaihtoehtoisista menetelmistä.

Traditionaalinen protokolla klonogeneettisiä määrityksiä varten

Kuva. 1 | Yhteenveto perinteisestä klonogeneettisestä protokollasta, jossa solut kylvetään, käsitellään ja sitten arvioidaan klonogeenisuus.

Klonogeneettiset määritykset tehdään tyypillisesti 6- tai 24-kuoppalevyissä. Solut on sijoitettava harvaan ja tasaisesti, jotta voidaan muodostaa eristettyjä pesäkkeitä. Siksi on tärkeää optimoida kylvötiheys valitsemallesi kuoppakoolle ennen klonogeenisen määrityksen suorittamista.

Hyvä lähtökohta on katsoa kirjallisuudesta, onko solulinjallasi tehty klonogeenisia määrityksiä, ja testata sitten tätä kylvötiheyttä ja kahta tai kolmea muuta. Tämän optimointiprosessin aikana on myös tärkeää ottaa huomioon kokeellinen päätepisteesi (esim. 7 päivää, 14 päivää tai 21 päivää) ja solujen kasvunopeus, koska et halua sulautuvia pesäkkeitä, jotka häiritsevät pesäkkeiden kvantifiointia ja analysointia. Kylvötiheyksien tulisi olla samat kaikissa kokeen käsittelyolosuhteissa.
Oikeiden kontrollien käyttäminen on kriittistä analyysivaiheessa. On aina käytettävä käsittelemätöntä kontrollia sekä pelkkää kantajaainetta sisältävää kontrollia (tämä voi olla DMSO, PBS tai mikä tahansa liuotin, johon käsittelysi on liuotettu). Hoito-olosuhteissa käytetään usein laimennossarjaa. Hoitoaika ja hoidon ankaruus auttavat määrittämään pitoisuusalueen – tämä vaatii todennäköisesti jonkin verran optimointia. Kukin kontrolli- ja koeolosuhde on suoritettava kolmena kappaleena.

Pesäkkeiden muodostusvaiheen aikana sinun on seurattava pesäkkeiden kasvua kaikissa käsittelyolosuhteissa. Pesäkkeeksi katsotaan vähintään 50 solua, ja ne näkyvät vain mikroskoopilla. Koska tämä määritys on tyypillisesti pitkäaikainen, sinun on vaihdettava solualustaa. Solujen konfluenssi on aluksi hyvin alhainen, joten elatusainetta ei tarvitse vaihtaa yhtä säännöllisesti kuin normaalisti. Jos kuitenkin kylvetät ja sitten käsittelet lääkkeellä tai yhdisteellä, on tärkeää ottaa huomioon sen puoliintumisaika ja lisätä uutta käsittelyä tarpeen mukaan.

Tutkijoille, jotka ovat kiinnostuneita pesäkkeen kasvun kuvaamisesta ajan myötä. Suosittelemme tutustumaan CytoSMART Omni -laitteeseen.

—————–

Kontrolliolosuhteissa olevat pesäkkeet kasvavat usein nopeimmin, ja siksi voit käyttää näitä soluja osoituksena kokeen loppupisteestä eli lopeta koe ennen kuin pesäkkeet alkavat sulautua yhteen, ja jos tämä tapahtuu liian nopeasti, käytä mieluummin pienempää kylvötiheyttä kokeessa. On tärkeää lopettaa koe kaikkien käsittelyolosuhteiden osalta samaan aikaan.

Kun olet saavuttanut kokeellisen päätepisteesi, solut on pestävä varovasti PBS:llä (lisää PBS:ää kuopan sivulle, jotta pesäkkeet eivät häiriinny), kiinnitettävä ja värjättävä DNA:ta interkaloivalla väriaineella, kristallivioletilla (0,5 % w/v) vähintään 30 minuutin ajan. Ylimääräisen väriaineen poistaminen voi olla sotkuista. Paras tekniikka on upottaa levyt varovasti veteen upotettuihin dekantterilaseihin, kunnes kaikki ylimääräinen väriaine on poistettu ja jäljellä on vain kirkkaan violetteja pesäkkeitä. Värjättyjä pesäkkeitä voidaan laskea jopa 50 viikkoa värjäyksen jälkeen. Ota kuopista korkearesoluutioisia kuvia, joita voit käyttää analyyseissä, esityksissä ja julkaisuluvuissa.

Tukeakseen tutkijoita pesäkkeiden muodostusmääritysten analysoinnissa ja optimoinnissa CytoSMART on ottanut käyttöön CytoSMART Omni -laitteelle sovelluksen, jolla voidaan havaita pesäkkeitä kokonaisten kuoppalevyjen (time-lapse) kuvista 10-kertaisella suurennoksella. Inkubaattorissa time-lapse -kuvantamisella voidaan antaa loppupisteen sijasta kineettistä tietoa, joka voi antaa yksityiskohtaisempaa tietoa siitä, milloin hoito alkaa vaikuttaa soluihin. Leimavapaata kuva-analyysiä käytetään pesäkkeiden havaitsemiseen, niiden koon ja pyöreyden arviointiin. Täsmennetään, milloin pesäkkeet alkavat yhdistyä, ja optimoidaan vastaavasti.

Miten klonogeneettistä määritystä analysoidaan

Se on oikeastaan niinkin yksinkertaista kuin laskea pesäkkeet manuaalisesti jokaisessa hoito-olosuhteessa ja esittää tiedot eloonjäämiskäyränä (käyrää varten tulisi käyttää vähintään kolmea biologista toistoa).

Eloonjäämiskäyrä edellyttää käsiteltyjen solujen eloonjäämisfraktion (SF) laskemista (tämä sisältää muodostuneiden pesäkkeiden suhteen kylvettyihin soluihin) ja sen kuvaamista hoitoannoksen suhteen. Ennen SF:n laskemista on määritettävä solujen levitystehokkuus (PE), sillä eri solulinjoilla on erilainen levitystehokkuus, mikä vaikuttaa eloonjäämisosuuden laskemiseen.

PE on pesäkkeiden määrän suhde käsittelemättömiin soluihisi kylvettyjen solujen määrään1. Kuvassa 1 esitetään PE- ja SF-kaavat ja esimerkki eloonjäämiskäyrästä.

Pesäkkeiden laskeminen manuaalisesti on työlästä ja voi olla altista vääristymille, joten on kehitetty useita vapaasti saatavilla olevia tietokonepohjaisia kuva-analyysityökaluja, joiden avulla voidaan analysoida klonogeneettisiä määrityskuvia nopeasti ja objektiivisesti. Mainitsemisen arvoinen on Brzozowskan ym. (2019) kehittämä vapaasti saatavilla oleva ohjelmistopaketti, joka ei ainoastaan laske pesäkkeitä vaan myös piirtää niiden kokojakaumat, mikä on toinen kerros hyödyllistä tietoa solukäyttäytymisestä (ks. kuva 2a).6

Vaihtoehto yksittäisten pesäkkeiden laskemiselle ja kvantifioimiselle on määrittää pesäkkeiden peittämän kuopan pinta-alan prosentuaalinen osuus pesäkkeiden peittämästä pinta-alasta (pesäkkeiden pinta-alan prosentuaalinen osuus), jotta voidaan kvantifioida klonogeenisten solujen kasvua. Guzmán ym. (2014) kehittivät vapaasti saatavilla olevan ImageJ-lisäosan nimeltä ColonyArea, joka tekee juuri tämän (ks. kuva 2b).7 Tämä on hyödyllinen työkalu, jota voi käyttää, jos sinulla on yhdistettyjä pesäkkeitä, joita on vaikea laskea silmämääräisesti tai pesäkelaskentaohjelmistolla, tai jos haluat nopean ja korkean läpimenoasteen analyysimenetelmän.

Kuva. 2 | Vapaasti saatavilla olevat klonogeneettisen määrityksen mittaustyökalut. (A) Brzozowska et al. kehittivät ohjelmiston (countPHICS), joka laskee pesäkkeitä ja mittaa pesäkkeiden kokoa.6 (B) Guzmán et al. kehittivät ImageJ:n lisäosan, ColonyArea, joka kvantifioi pesäkkeiden kasvualuetta ja värjäytymisen voimakkuutta.7

Label-free, non-endpoint, semi-automatisoitu klonogeeninen määritysprotokolla

Mayrin ym. (2018) tuoreessa artikkelissa kuvataan uusi ja muokattu klonogeeninen määritysprotokolla, jossa pesäkkeiden mittaamiseen käytetään 96-kuoppaisen mikrolevyn formaattia ja konfluenssin havaitsemista. Tämä menetelmä mahdollistaa kattavat koeasetelmat 96-kuoppalevyllä, se on merkkausvapaa, siinä ei ole värjäyspäätettä ja analyysi on puoliautomaattinen (kuva 3)8. Lisäksi samasta kuopasta tehty aikaresoluutioitu, ei-päätepisteellinen konfluenssimittaus osoitti, että puoliautomaattinen analyysi soveltuu pesäkkeiden lukumäärän ja keskikoon määrittämiseen.

Figure. 3 | Mayr ym. arvioivat klonogeenistä kasvua 96-kuoppamuodossa ajan kuluessa konfluenssin havaitsemisen avulla8. Kuvaajassa esitetään klonogeenisen kasvun kvantifiointi eri aikapisteissä, ja kuvissa näkyvät tietyt kuopat, joissa on konfluenssidetektori. Vihreät täplät edustavat konfluenssilukijalla havaittuja alueita, ja oranssit nuolet osoittavat yhdistyneet pesäkkeet.

Tämä klonogeeninen määritysmenetelmä tarjoaa aika- ja kustannustehokkaan vaihtoehdon tavanomaiselle klonogeeniselle määritysprotokollalle. Koska loppupisteen kiinnittämistä ja värjäystä ei tarvita, tämä protokolla mahdollistaa klonogeenisen kasvun jatkuvan seurannan ja analysoinnin. Lisäksi pesäkkeiden kasvun kinetiikkaa koskevia lisämittareita voidaan poimia kokeen aikana. Miniatyrisoitu formaatti avaa myös mahdollisuuden testata kalliita hoitomuotoja, kuten siRNA-pohjaisia tai CRISPR/Cas9-pohjaisia hoitoja, joita ei olisi mahdollista toteuttaa 6- tai 24-kuoppalevyn vaatimalla hoitomäärällä. Loppujen lopuksi Mayr et al. osoittivat, että merkitsemätön mikroskopia ja konfluenssin havaitseminen ovat vankka ja käyttökelpoinen vaihtoehto klonogeenisuuden mittaamiseen.

Labelivapaa, päättymätön ja automatisoitu ratkaisu klonogeenisiin määrityksiin on CytoSMART Omni, jossa on pesäkkeiden havaitsemisalgoritmi. Pesäkkeiden muodostumista mitataan ajan mittaan koko kuopassa pesäkkeiden lukumäärän, koon ja ympyrämäisyyden lukemien avulla. Solujen ei tarvitse poistua inkubaattorista, ja solukineettistä tietoa saadaan pesäkkeiden muodostumisprosessin aikana (kuva 4).

Kuva 4 | Automaattinen pesäkkeiden havaitseminen CytoSMART Omni -laitteella. HEP-G2-maksasyöpäsoluja 24-kuoppalevyssä kuvattiin 75 tunnin ajan CytoSMART Omni -laitteella, jota pidetään tavallisessa CO2-inkubaattorissa. Kuvassa näkyy täysi kuoppa pesäkkeiden havaitsemisalgoritmin suorittamisen jälkeen, ja oranssilla pesäkemaskilla korostetut soluryhmät. Pesäkkeiden lukumäärää, kokoa ja ympyrämäisyyttä mitattiin koko määrityksen keston ajan, ja ne näkyvät kuvaajissa.

Tutustu kaikkiin CytoSMART-kuvantamisratkaisuihin täällä