Mechanisms of resistance to fluoroquinolones and carbapenems in Pseudomonas putida

Abstract

Objectives: Pseudomonas putida on harvinainen opportunistinen patogeeni, joka on yleensä herkkä mikrobilääkkeille. Kliinisten P. putida -isolaattien resistenssistä mikrobilääkkeille on vain vähän tietoa.

Potilaat ja menetelmät: Herkkyys fluorokinoloneille, karbapeneemeille ja muille antibiooteille luonnehdittiin viidellä kliinisellä P. putida -isolaatilla, jotka oli saatu talteen eri potilailta, joilla oli virtsatieinfektioita aiheuttajina. Fluorokinoloni- ja karbapeneemiresistenssi karakterisoitiin geneettisesti PCR- ja DNA-sekvensointimenetelmillä. Ulkokalvoproteiiniprofiileja (OMP) luonnehdittiin SDS-PAGE:lla.

Tulokset: Neljä viidestä isolaatista oli resistenttejä tai keskiresistenttejä sekä fluorokinoloneille että karbapeneemeille. Kinoloniresistenssiä määrittävien alueiden nukleotidisekvenssit viittasivat siihen, että aminohappomutaatiot, kuten Thr-83→Ile GyrA:ssa ja Glu-469→Asp GyrB:ssä, voivat vaikuttaa korkeaan fluorokinoloniresistenssiin. Neljä metallo-β-laktamaasia tuottavaa isolaattia, jotka osoittivat resistenssiä karbapeneemeille, kantoi IMP-tyypin metallo-β-laktamaasigeenejä. Karbapeneemien korkeimmat MIC-arvot osoittava P. putida -isolaatti osoitti 46 kDa:n OMP:n ja metallo-β-laktamaasituotannon vähentyneen tuotannon yhteisvaikutuksen.

Johtopäätökset: Tässä tutkimuksessa tunnistettiin fluorokinolonien ja karbapeneemien resistenssimekanismeja kliinisissä P. putida -isolaateissa.

Esittely

Pseudomonas putida, ei-fermentoiva gramnegatiivinen bakteeri, on opportunistinen ihmisen patogeeni, joka aiheuttaa bakteremiaa ja sepsistä vastasyntyneillä, neutropeniapotilailla ja syöpäpotilailla sekä virtsatietulehduksia.1-4 Vaikka P. putida on harvinainen, se voi aiheuttaa nosokomiaalisia infektioita huonokuntoisilla isäntäkuntia sairastavilla ihmisillä.3

Useimmat P. putida -bakteerit ovat herkkiä mikrobilääkkeille, kuten karbapeneemeille, fluorokinolonille ja aminoglykosideille.5-7 On kuitenkin raportoitu P. putida -bakteerin kliinisiä isolaatteja, jotka tuottavat metallo-β-laktamaaseja, jotka antavat resistenssin β-laktameille, mukaan lukien karbapeneemit.3,4,8,9. Lisäksi hiljattain raportoitiin metallo-β-laktamaaseja tuottavia isolaatteja, jotka osoittivat resistenssiä siprofloksasiinille, gentamysiinille ja tobramysiinille β-laktamiinien lisäksi3 . Useille lääkeaineille vastustuskykyisen P. putida -bakteerin ilmaantumisesta on tullut vaikeuksia infektioiden hoidossa, ja se aiheuttaa sairaalainfektioiden leviämisriskin.

Muutamissa aiemmissa tutkimuksissa P. putida -bakteerin antibioottiresistenssiä on luonnehdittu metallo-β-laktamaasien tuotannon ja effluksijärjestelmien ominaisuuksien perusteella.3,4,8-12 Euroopasta, Koreasta ja Japanista saatujen raporttien mukaan karbapeneemiresistentti P. putida tuottaa usein IMP- ja VIM-tyyppisiä metallo-β-laktamaaseja.3,4,8,9,9a Effluksisysteemit, kuten TtgABC, MepABC, TtgDEF ja ArpABC, voivat myös myötävaikuttaa monilääkeresistenssin syntyyn P. putidassa.10-12Pseudomonas aeruginosa pystyy muuttumaan vastustuskykyiseksi nopeasti hoidon aikana,13 vaikka ei ole epäselvyyttä siitä, onko vastaavaa potentiaalia myös P. putidassa. Antibioottiresistenssin syntymiseen liittyvien riskien arvioimiseksi tarvitaan runsaasti tietoja mikrobilääkeresistenssistä kliinisissä P. putida -isolaateissa. Tässä tutkimuksessa määritimme herkkyydet mikrobilääkkeille, mukaan lukien fluorokinolonit ja karbapeneemit, ja luonnehdimme fluorokinolonien ja karbapeneemien resistenssimekanismeja kliinisissä P. putida -isolaateissa, jotka kerättiin talteen virtsatietulehduksia aiheuttavina taudinaiheuttajina sairaalassamme yhden vuoden aikana.

Potilaat ja menetelmät

Potilaat

Viisi potilasta (neljä urospuolista ja yksi naispuolinen potilas), joilla oli akuutti, toistuvasti esiintyvä tai krooninen virtsatietulehdus ja jotka olivat saaneet tautia, jotka oli aiheuttanut P. putida. putidan aiheuttamat UTI:t Hamamatsun yliopistollisessa sairaalassa, otettiin mukaan tutkimukseemme lokakuusta 2001 syyskuuhun 2002.

Bakteerikannat ja mikrobiologiset menetelmät

Tässä tutkimuksessa käytettiin viittä kliinistä P. putida -isolaattia, jotka saatiin talteen eri potilailta taudinaiheuttajina. Tunnistaminen suoritettiin tavanomaisilla biokemiallisilla testeillä kliinisen mikrobiologian laboratoriossamme. Kaikki isolaatit oli saatu virtsasta. Näiden viiden isolaatin kromosomaalisen DNA:n SpeI-rajoitteiset fragmenttikuviot vaihtelivat (kuva 1). Bakteerit säilytettiin -70 °C:ssa sydäninfuusioliemessä (Nissui Pharmaceutical, Tokio, Japani), joka sisälsi 20 % glyserolia. Tämän jälkeen bakteerit inokuloitiin sydäninfuusioagarilevyille (Nissui Pharmaceutical) ja inkuboitiin 37 °C:ssa yön yli. MIC-arvot määritettiin agar-laimennusmenetelmällä Clinical and Laboratory Standards Instituten (CLSI), aiemmin National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), kuvaamalla tavalla.14 Herkkyystestit tehtiin Mueller-Hinton-agarilla (Nippon Becton Dickinson, Tokio, Japani) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Keftatsidiimin, imipeneemin, meropeneemin, norfloksasiinin, levofloksasiinin, gatifloksasiinin, gatifloksasiinin, gentamysiinin, amikasiinin ja minosykliinin MIC-tulkintakriteerit noudattivat CLSI/NCCLS:n kriteerejä.14 Muiden mikrobilääkkeiden MIC-murtopisteitä ei määritelty.

Antimikrobilääkkeet

Kinoloniresistenssiä määrittävien alueiden monistaminen ja DNA-sekvensointi

Kromosomaalinen DNA uutettiin P. putida -isolaateista aiemmin kuvatulla tavalla.15 PCR-monistaminen suoritettiin spesifisillä alukesarjoilla. Alukesarja 5′-gacggcctgaagccgccggtgcac-3′ ja 5′-gcccacggcgcgataccgctgga-3′ monisti 417 bp:n pituisen pätkän gyrA-geenin kinoloniresistenssiä määrittävistä alueista (QRDR) asemista 115-531.16 Alukesarja 5′-agtacttcgccgccgacttcct-3′ ja 5′-tacaggcgcgcgacaggcgcgctt-3′ monisti 739 bp:n pituisen pätkän gyrB-geenin QRDR-alueista asemista 1073-1811.17 Alukesarja 5′-tctacggccatgagcgaactgg-3′ ja 5′-agcagcacctcggaatagcg-3′ monisti 262 bp:n pituisen fragmentin parC-geenin QRDR:stä asemista 158-419.18 Monistukset tehtiin Advantage-GC2-entsyymillä (BD Biosciences Clontech Japan, Tokio, Japani) valmistajan ohjeiden mukaisesti. QRDR:t sekvensoitiin käyttämällä BigDye terminator v3.0 Taq cycle sequencing ready reaction kit -reaktiosarjaa, jossa oli AmpliTaq DNA-polymeraasi (Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA), ja automatisoitua DNA-sekvensointijärjestelmää (ABI PRISM 310 -geenianalysaattori, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Metallo-β-laktamaasigeenien geneettinen havaitseminen

Ulkomembraaniproteiinien valmistaminen

Ulkomembraaniproteiinit (OMP) valmistettiin aiemmin kuvatulla tavalla.21 Näytteet analysoitiin SDS-PAGE:lla.

Tulokset

Herkkyys

Fluorokinolonien ja karbapeneemien herkkyysmääritysten tulokset on esitetty yhteenvetona taulukoissa 1 ja 2. β-laktamien MIC-arvot vaihtelivat ampisilliinin ja kefaloridiinin osalta välillä >128 mg/l, keftatsidiimin osalta välillä 2 – >128 mg/l, imipeneemin osalta välillä 1 – 128 mg/l, panipeneemin osalta välillä 0,5 – >128 mg/l, meropeneemin osalta välillä 4 – >128 mg/l ja biapeenemin osalta välillä 1 – >128 mg/l. Aminoglykosidien ja minosykliinin MIC-alueet olivat seuraavat: 0,25-8 mg/l gentamisiinille, 0,5-8 mg/l amikasiinille, 0,5-1 mg/l kanamysiinille ja 4-64 mg/l minosykliinille. Neljä isolaattia oli resistenttejä tai keskiresistenttejä sekä fluorokinoloneille että karbapeneemeille, kun taas yksi isolaatti, HU2001-429, oli herkkä sekä β-laktameille että fluorokinoloneille. Kolme P. putida -isolaattia, HU2001-412, HU2001-419 ja HU2001-451, osoitti resistenssiä kaikille tutkituille β-laktameille, kuten keftatsidiimille, imipeneemille ja meropeneemille. Kolmella isolaatilla, HU2001-412, HU2001-419 ja HU2002-467, todettiin korkea fluorokinoloniresistenssi (>128 mg/l), mukaan luettuina norfloksasiini, levofloksasiini, sparfloksasiini, gatifloksasiini ja patsufloksasiini, sekä minosykliiniresistenssi (32-64 mg/l). Viidessä isolaatissa sitafloksasiinin MIC-alue oli välillä ≤0,125-8 mg/l.

Fluorokinoloniresistenssi

Karbapeneemiresistenssi

Viidestä P. putida -isolaatista neljässä karbapeneemiresistenssiä osoittavassa isolaatissa esiintyi IMP-tyypin metallo-β-laktaamaasigeeni, kun taas VIM-tyypin metallo-β-laktaamaasigeenejä ei havaittu PCR:llä (taulukko 2). IMP-tyypin metallo-β-laktamaasigeenejä kantavan P. putidan karbapeneemien MIC-alueet olivat seuraavat: 8-128 mg/l imipeneemille, 32->128 mg/l panipeneemille, 128 mg/l tai enemmän meropeneemille ja 32->128 mg/l biapenemille. P. putida HU2001-451:llä, jolla oli viidestä isolaatista korkeimmat karbapeneemien MIC-arvot, 46 kDa:n OMP:n tuotantoa ei voitu havaita SDS-PAGE:lla, kun taas P. putida HU2001-412:n, HU2001-419:n, HU2001-429:n ja HU2002-467:n OMP:n tuotantoa ei voitu havaita samalla tavalla (taulukko 2).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa luonnehdimme herkkyyttä fluorokinoloneille ja karbapeneemeille viidessä kliinisessä P. putida -isolaatissa, jotka oli eristetty eri potilaista, joilla oli akuutti, toistuva tai krooninen virtsatietulehdus. Kaikilla viidellä isolaatilla oli erilaiset PFGE-genotyypit, mikä viittasi siihen, että yksikään näiden P. putidan aiheuttamista infektioista ei ollut nosokomiaalinen. Neljä viidestä isolaatista oli resistenttejä tai keskiresistenttejä sekä fluorokinoloneille että karbapeneemeille. Kolmella isolaatilla oli korkea resistenssi (>128 mg/L) kaikille tutkituille fluorokinoloneille paitsi sitafloksasiinille. Tässä tutkimuksessa tutkituista fluorokinoloneista sitafloksasiini osoitti ylivoimaista tehoa P. putida -isolaatteja vastaan. Nämä fluorokinolonille erittäin resistentit isolaatit olivat resistenttejä myös karbapeneemeille ja minosykliinille. Kaikki isolaatit olivat herkkiä aminoglykosideille, kuten amikasiinille.

P. putida -organismin fluorokinoloniresistenssiä koskevia tutkimuksia on tehty vain vähän.6,12 P. aeruginosa -organismin fluorokinoloniresistenssin tärkeimpiä mekanismeja P. aeruginosa -organismin fluorokinoloniresistenssissä ovat muun muassa aminohappomutaatiot DNA:n gyraasissa tai topoisomeraasi IV:ssä, jotka johtuvat mutaatioiden aiheuttamista mutaatioista GyrA:n ja ParC:n QRDR-radioosista, kun taas joissakin raportoinneissa on ehdotettu, että myös mutaatioiden osallistumisella on vaikutusta GyrB:ssä esiintyviin mutaatioihin.18,22 P. aeruginosan sekundaarinen resistenssimekanismi, johon liittyy efflux-järjestelmiä, vaikuttaa osaltaan alentuneeseen herkkyyteen fluorokinoloneille.22,23 Tässä tutkimuksessa verrattiin GyrA:n, GyrB:n ja ParC:n QRDR-mutaatioiden aminohappomuutoksia viiden kliinisen P. putida -isolaatin välillä. Fluorokinoloniresistentillä P. putidalla oli lisämutaatioita, kuten Thr-83→Ile GyrA:ssa ja Glu-469→Asp GyrB:ssä, jotka vastasivat mutaatioita, joita on havaittu fluorokinoloniresistenssissä P. aeruginosa -bakteerissa.22,23 Nämä tulokset osoittavat, että QRDR:n aminohappomutaatiot, kuten Thr-83→Ile GyrA:ssa ja Glu-469→Asp GyrB:ssä, voivat vaikuttaa fluorokinoloniresistenssin korkeaan tasoon, vaikkakaan ei ole selvitetty, alentaisiko luonnonvaraista gyrA-, gyrB- tai parC-geeniä kantavien plasmidien transformaatio tällaisiin isolaatteihin fluorokinolonien MIK-arvoja.24 Sitafloksasiinin MIK-arvojen vaihteluväli vaihteli viidellä P. putida -isolaatilla välillä ≤0,125 ja 8 mg/l. Vaikka aiemmat raportit ovat osoittaneet, että TtgABC-, MepABC-, TtgDEF- ja ArpABC- efflux-järjestelmien yliekspressio voi myös vaikuttaa monilääkeresistenssiin P. putidassa,10,11,12 efflux-järjestelmien rooli jäi epäselväksi tässä tutkimuksessa.

Metallo-β-laktamaasien tuotannosta johtuvasta karbapeneemiresistenssistä P. putidassa on raportoitu.3,4,8,9,9,9a Näihin P. putidassa havaittuihin metallo-β-laktamaaseihin kuului IMP- ja VIM-tyyppejä.3,4,8,9,9,9a Neljässä karbapeneemiresistentissä P. putidassa metallo-β-laktamaasien tuotanto havaittiin levydiffuusiomenetelmällä (tietoja ei ole esitetty). Näissä isolaateissa oli IMP-tyypin metallo-β-laktamaasigeenejä, kun taas VIM-tyypin metallo-β-laktamaasigeenejä ei havaittu PCR:llä. Metallo-β-laktamaaseja tuottavan P. putida -bakteerin esiintyvyys on merkittävä kliininen ongelma, sillä se on β-laktamiresistenssin geneettisten determinanttien varasto. P. aeruginosan muihin tärkeimpiin karbapeneemiresistenssimekanismeihin kuuluu mutaatioiden aiheuttama läpäisemättömyys, joka johtuu OprD:n – huokosta muodostavan transmembraanikanavan, johon karbapeneemit mutta eivät muut β-laktamaamit pääsevät käsiksi – menettämisestä, sekä metallo-β-laktamaasien tuottaminen21,25,26 . OprD:n menetys johtaa imipeneemiresistenssiin ja heikentyneeseen herkkyyteen meropeneemille P. aeruginosa -bakteerissa.27 P. putida HU2001-451 -bakteerissa, jolla oli neljän karbapeneemiresistentin isolaatin joukossa korkeimmat MIC-arvot (≥128 mg/l) kaikista karbapeneemeistä, 46 kDa:n suuruisen OMP:n tuotanto oli vähentynyt muiden isolaattien tuotantoon verrattuna. P. putida HU2001-451:n OMP-profiilit olivat samankaltaisia kuin karbapeneemiresistentin P. aeruginosan, jossa aiemmassa tutkimuksessamme havaittiin OprD:n vähentynyttä tuotantoa21. Nämä tulokset osoittivat, että 46 kDa:n OMP:n vähentyneellä tuotannolla ja metallo-β-laktamaasien tuotannolla oli yhteisvaikutus isolaatin karbapeneemiresistenssiin, vaikka oli epäselvää, oliko muilla β-laktamaaseilla merkitystä karbapeneemiresistenssin kannalta.

Johtopäätöksinä voidaan todeta, että luonnehdimme fluorokinoloni- ja karbapeneemiresistenssiä kliinisissä P. putida -isolaateissa. Tuloksemme osoittavat, että QRDR:ien aminohappomutaatiot, kuten Thr-83→Ile GyrA:ssa ja Glu-469→Asp GyrB:ssä, voivat vaikuttaa P. putidan korkeaan fluorokinoloniresistenssiin. Neljä metallo-β-laktamaasia tuottavaa P. putida -isolaattia, jotka osoittivat resistenssiä karbapeneemeille, kantoi IMP-tyypin metallo-β-laktamaasigeeniä. Havaitsimme 46 kDa:n OMP:n vähentyneen tuotannon ja metallo-β-laktamaasien tuotannon yhteisvaikutuksen, joka lisäsi karbapeneemiresistenssiä eräässä P. putida -isolaatissa, jolla oli korkeimmat MIC-arvot karbapeneemeille.

Kiitämme Miroku Medical Laboratorya, Saku, Nagano, Japani, PFGE-analyysistä. T. H. on saanut tukea Japanin opetus-, kulttuuri-, urheilu-, tiede- ja teknologiaministeriön myöntämästä tieteellisen tutkimuksen apurahasta (Grant-in-Aid for Scientific Research, 17790353).