Tulokset
Merkityn GATA-1:n tehokas biotinyloituminen transfektoiduissa soluissa. Merkittyjen proteiinien spesifistä in vivo -biotinylaatiota nisäkässoluissa koskeva suunnitelma on esitetty kuvassa 1A. Menettelyn mukaan pieni (23 aa) peptidimerkki fuusioidaan kiinnostavaan proteiiniin ja sitä ekspressoidaan soluissa yhdessä BirA:n, bakteeriproteiini-biotiiniligaasin (20) kanssa. Käytetty peptidimerkki on aiemmin eristetty synteettisestä peptidikirjastosta, joka on seulottu BirA-välitteisen biotinylaation varalta, joka tapahtuu erityisesti merkin lysiinijäämässä (16). Proteiinitietokantahauissa ei ole löydetty luonnossa esiintyviä proteiineja, joilla olisi samanlainen sekvenssimotiivi kuin peptidimerkillä
(A) Kaavio merkityn GATA-1:n spesifisestä biotinyloinnista BirA-biotiiniligaasilla MEL-soluissa. GATA-1:n N-terminaaliin fuusioidun 23-aa:n peptidimerkin sekvenssi on esitetty. Tähdellä on merkitty lysiinijäännös, jonka BirA spesifisesti biotinyloi. Pilkulliset laatikot osoittavat kahden GATA-1:n sinkkisormen paikat. Merkityt GATA-1 ja BirA kloonattiin erikseen nisäkkään erytroidi-ekspressiokasettiin ja niitä ekspressoitiin yhdessä MEL-soluissa. (B) Merkityn GATA-1:n biotinyloituminen MEL-soluissa. (Vasen) Western blot anti-GATA-1-vasta-aineella endogeenisten ja merkittyjen GATA-1-proteiinien havaitsemiseksi. (Oikea) Western blot samoista uutteista streptavidiini-HRP-konjugaatilla biotinyloidun GATA-1:n havaitsemiseksi. Kaksoistransfektanttien (kaistat 1 ja 5) ja yksittäisten transfektanttien (kaistat 2, 3, 6 ja 7) ydinuutteet (5 μg kaistaa kohti) testattiin merkitylle GATA-1:lle ja Bir A:lle. Kaistat 4 ja 8, ydinuute ei-transfektoiduista MEL-soluista. Biotinyloitu GATA-1 (tähti) näkyy selvästi vain kaksoistransfektoitujen solujen kaistalla. Osoitetaan myös streptavidiinilla havaittu vähäinen tausta pelkkää BirA:ta ilmentävien MEL-solujen ydinuutteissa (oikealla, kaista 7). (C) GATA-1:n biotinylaation tehokkuus ja sitoutuminen streptavidiinihelmiin. (Vasen) Western blot anti-GATA-1-vasta-aineella merkityn GATA-1:n sitoutumisen havaitsemiseksi streptavidiinihelmiin (kaista 2; sitoutumisen lähtöaineena oli 2,5-kertainen määrä tulokaistalla esitettyyn ydinuutteeseen verrattuna). Lähtöaine ja sitoutumaton aineisto on esitetty kaistoilla 1 ja 3. (Oikealla) Sama suodatin, joka on strippattu ja uudelleen värjätty streptavidiini-HRP:llä biotinyloidun GATA-1:n sitoutumisen havaitsemiseksi streptavidiinihelmiin (kaista 5). Kaista 6 osoittaa, että hyvin vähän merkattua GATA-1:tä jää sitoutumatta streptavidiiniin. Tässä sitoutumiskokeessa helmet pestiin tiukoissa olosuhteissa (0,5 M NaCl/0,3 % Triton X-100 PBS:ssä). In, panos (ydinuute); El, eluoitunut materiaali; Un, sitoutumaton materiaali.
Proteiini, jota merkitsimme tätä järjestelmää testatessamme, oli välttämätön hiiren hematopoieettinen transkriptiotekijä GATA-1 (katsaus, ks. viite 25). Tunniste fuusioitiin N-terminaalisesti GATA-1:een ja ekspressoitiin ihmisen β-globiinin ekspressiokasetin valvonnassa MEL-soluissa, jotka voidaan indusoida erytroidisolujen terminaaliseen erilaistumiseen (22). Myös BirA kloonattiin ja ekspressoitiin MEL-soluissa käyttäen ihmisen globiini-ekspressiokasettia. Kloonit, jotka vastasivat merkityn GATA-1:n ja BirA:n yksittäisiä ja kaksinkertaisia stabiileja transfektantteja, eristettiin ja seulottiin aluksi molempien konstruktioiden ilmentymisen varalta. GATA-1:n tapauksessa Western blot -analyysi, jossa käytettiin GATA-1-vasta-ainetta, havaitsi hitaammin liikkuvan merkityn proteiinin sekä endogeenisen GATA-1:n transfektoitujen solujen ydinuutteissa (kuva 1B, kaistat 1 ja 2). BirA:n ilmentyminen analysoitiin RNA-tasolla (tietoja ei ole esitetty).
Testasimme seuraavaksi valituilla stabiileilla transfektanteilla, biotinyloiko BirA merkityn GATA-1-proteiinin. MEL-solukloonien ydinuutteiden tutkiminen streptavidiini-HRP-konjugaatilla osoitti merkattua GATA-1-proteiinia vastaavan voimakkaan signaalin, joka oli havaittavissa vain merkatun GATA-1/BirA-kaksoistransfektantin kaistalla (kuva 1B, kaista 5). Merkityn GATA-1:n biotinylaatiota ei näkynyt ilman BirA:ta (kuva 1B, kaista 6). Nämä havainnot vahvistavat, että BirA-proteiini syntetisoituu aktiivisessa muodossa transfektoiduissa MEL-soluissa. Lisäksi havaitaan hyvin vähän epäspesifistä taustabiotinylaatiota MEL-solujen ydinuutteissa, jotka ilmentävät vain BirA:ta (kuva 1B, kaista 7). Näin ollen päättelemme, että bakteerien BirA-proteiini-biotiiniligaasin ilmentäminen MEL-soluissa voi spesifisesti biotinyloida nisäkäsperäisen transkriptiotekijän, jossa on yksilöllinen peptidimerkki.
Testasimme seuraavaksi biotinyloinnin tehokkuutta sitomalla raa’an solunydinuutteen sisältämän merkityn GATA-1:n streptavidiiniparamagneettisiin Dynabeads-hiomoihin (Kuva 1C). Helmistä eluoituneen materiaalin analysointi osoitti, että lähes kaikki merkitty GATA-1-proteiini oli sitoutunut (vertaa kaistaa 2 kaistoihin 1 ja 3, kuva 1C). Saman suodattimen uusiminen streptavidiini-HRP:llä osoittaa ≈100 %:n tehokkuutta merkityn GATA-1:n biotinyloitumisessa ja kiinnittymisessä helmiin (kuva 1C, kaistat 4 ja 5). Lisäksi, kuten kuvassa 1B havaittiin, endogeenisesti biotinyloitujen proteiinien sitoutuminen helmiin on vähäistä, kuten streptavidiini-HRP:llä havaitaan (kuva 1C, kaista 5). Nämä tiedot osoittavat, että merkitty GATA-1 biotinyloituu erittäin tehokkaasti ja saadaan talteen uutteista streptavidiiniin sitoutumalla, ja taustabiotinyloituminen on vähäistä.
Biotinyloidun GATA-1:n yksivaiheinen puhdistus raaoista ydinuutteista streptavidiiniin sitoutumalla. Tutkimme myös yksivaiheisen puhdistuksen toteutettavuutta biotinyloidun GATA-1:n eristämisessä raaoista ydinuutteista sitomalla se suoraan streptavidiinihelmiin kohtuullisen tiukasti (150 mM NaCl/0,3 % Nonidet P-40/200 ng/μl kanan seerumialbumiinia). Kokeilimme ensin kontrollisidontaa 5 mg:sta raakoja ydinuutteita MEL-soluista, jotka ilmentävät vain BirA:ta (kuva 2, kaista 4). Eluoitunut materiaali koostui noin viidestä voimakkaasti värjäytyneestä kaistasta, joiden taustalla oli paljon heikompia kaistoja (kuva 2, kaista 5). Tunnistimme taustaa sitovat proteiinit poistamalla koko kaistan geelistä ja analysoimalla sen nestekromatografia-tandem-MS:llä. Näin tunnistetut proteiinit on luokiteltu taulukossa 1 Gene Ontology Consortiumin (www.geneontology.org) määrittelemien biologisten toimintojen ja solulokeroiden mukaan. Tulokset osoittivat, että runsaimmat tunnistetut taustaproteiinit olivat luonnollisesti biotinyloidut karboksylaasit ja niihin liittyvät entsyymit, jotka olivat suurelta osin yhteneväisiä voimakkaasti värjäytyvien kaistojen kanssa. Löysimme myös mRNA:n prosessointiin osallistuvien runsaiden ydinproteiinien, kuten splikointitekijöiden, sekä ribosomiproteiinien taustasidonnaisuutta. Yhdessä nämä kolme proteiiniluokkaa muodostivat >80 % taustasidonnasta käytetyissä olosuhteissa (taulukko 1). On huomattava, että hyvin harvat peptidit tunnistettiin vastaaviksi transkription säätelyyn osallistuville tekijöille (taulukko 1). Johtopäätöksemme on, että streptavidiinihelmiin tapahtuva taustasidonta johtuu pääasiassa endogeenisistä biotinyloiduista proteiineista sekä mRNA:n prosessointiin ja ribosomisynteesiin ja -kokoonpanoon osallistuvista runsaslukuisista ydintekijöistä, ja transkription säätelyyn/aktivointiin osallistuvien tekijöiden epäspesifinen sitoutuminen on hyvin vähäistä.
Kolloidisinisellä värjätty geeli raa’an ydinuutteen sitoutumiskokeesta streptavidiinihelmiin. Kaista 1, merkkiaine (M). Lane 2, merkityistä GATA-1/BirA-kaksoistransfektoiduista soluista saatu tuloydinuute (≈12 μg). Kaista 3, proteiinit, jotka eluoituvat sen jälkeen, kun ≈5 mg merkityistä GATA-1/BirA-transfektoiduista soluista saadut raa’at ydinuutteet on suoraan sidottu streptavidiinihelmiin. Kaista 4, merkityistä GATA-1/BirA-transfektoiduista soluista saatu ydinuute. Kaista 5, proteiinit, jotka eluoituvat sitoutumisen jälkeen streptavidiinihelmiin ≈5 mg BirA-transfektoitujen solujen ydinuutetta. Nuoli kaistalla 3 osoittaa proteiinikaistaa, joka sisältää puhdistettua biotinyloidun GATA-1:n, MS-menetelmällä määritettynä.
- Katso rivissä
- Katso ponnahdusikkunassa
Seuraavaksi kokeilimme sitoa vastaavan määrän raakaa ydinuutetta (5 mg) merkityistä GATA-1/BirA-kaksoistransfektanteista samoissa olosuhteissa (Kuva 2, kaista 2). Eluoitunutta materiaalia sisältävän kaistan värjäytymiskuvio (Kuva 2, kaista 3) poikkesi merkittävästi siitä, mitä havaittiin taustasitoutumisella kaistalla 5, mikä osoittaa merkittävää rikastumista merkityn GATA-1:n kanssa yhteyttävien proteiinien osalta (Kuva 2, kaista 3 vs. kaista 5). Biotinyloidut GATA-1:n ja sen kanssa yhteenkietoutuvien proteiinien sitoutuminen voi laimentua tai kilpailla sitoutumisesta kaistalla 5 havaittujen epäspesifisten proteiinien kanssa. Kaistalla 3 näkyvä proteiinirikastuma voi siten vastata kopurifioituneita GATA-1:n kanssa vuorovaikutuksessa olevia proteiineja. Eluoituneessa materiaalissa havaittiin myös vahvasti värjäytynyt kaistale, jonka koko oli samankokoinen kuin merkityn GATA-1:n odotetaan olevan (kuva 2, nuoli, kaista 3). Vahvistimme GATA-1:n läsnäolon tässä kaistassa geelipoistolla ja MS-menetelmällä. Kaikkien merkityn GATA-1:n kanssa kopurioituvien proteiinien yksityiskohtainen analyysi julkaistaan muualla (P.R., F.G. ja J.S., julkaisemattomat tulokset). Kaiken kaikkiaan nämä tiedot osoittavat merkityn GATA-1:n kvantitatiivisen biotinyloinnin MEL-soluissa ja sen tehokkaan puhdistuksen raakaproteiiniuutteista yksivaiheisessa menettelyssä sitomalla se suoraan streptavidiinihelmiin, jossa on vain vähän taustasitoutumiskaistoja, jotka vastaavat pääasiassa endogeenisesti biotinyloiduista proteiineista ja helposti tunnistettavista runsaslukuisista ydin-/nukleolaariproteiineista.
Biotinylointi ei vaikuta GATA-1:n proteiineihin vaikuttaviin tai DNA:ta sitoviin ominaisuuksiin. Koska on mahdollista, että peptidimerkin lisääminen ja/tai biotinylointi vaikuttaa merkityn proteiinin ominaisuuksiin, testasimme, voiko biotinyloidulla GATA-1:llä silti olla proteiini-proteiini-interaktioita tunnetun GATA-1-kumppanin, kuten FOG-1:n (26), kanssa ja voiko se sitoutua in vivo tunnettuihin GATA-1-geenin kohdekohteisiin, kuten hiiren βmaj-globiinipromoottoriin. Suoritimme biotinyloidun GATA-1:n pull-down-kokeen sitomalla ydinuutteet streptavidiinihelmiin ja testasimme, kopurioituuko myös FOG-1. Havaitsimme FOG-1:n vetäytyvän alas uutteista, jotka ilmentävät biotinyloitua GATA-1:tä, mutta ei uutteista, jotka ilmentävät vain BirA:ta (kuva 3A, kaistat 2 ja 4). Havaitsimme myös FOG-1:n kopurifioituvan biotinyloidun GATA-1:n kanssa MS-menetelmällä. Teimme myös kromatiinin pull-down-kokeen (ChIP), jossa formaldehydillä ristisilloitetuista MEL-soluista sonikoitua kromatiinia inkuboitiin streptavidiinihelmien kanssa, minkä jälkeen sidottu materiaali eluoitiin ja pulled-down-dna otettiin talteen. Käyttämällä βmaj-promoottorille spesifisiä alukkeita havaitsimme näiden sekvenssien rikastumisen biotinyloitua GATA-1:tä ilmentävien solujen kromatiinista vedetyssä DNA:ssa, mutta ei BirA:ta ilmentävien solujen kromatiinista vedetyssä DNA:ssa (kuva 3B). Olemme myös havainneet, että biotinylointi ei vaikuta GATA-1:n normaalisti havaittuun subnukleaariseen jakaumaan (kuva 5, joka on julkaistu tukitietona PNAS-sivustolla; viite 27) ja että biotinyloidulla GATA-1:llä on samanlainen biokemiallinen fraktioitumisprofiili kuin endogeenisella GATA-1:llä MEL-solujen solujen ydinuutteissa (tietoja ei ole esitetty). Yhdessä nämä tulokset ovat vahva todiste siitä, että biotinylaatiomerkintä ei vaikuta GATA-1:n ominaisuuksiin. Lisäksi nämä tiedot osoittavat, että biotinylaatiomerkintää voidaan käyttää vaihtoehtona vasta-aineille menetelmissä, joihin liittyy affiniteettipuhdistusvaihe, kuten proteiinien pull-down-menetelmissä tai ChIP-määrityksessä.
(A) Biotinyloidun GATA-1:n sitoutuminen streptavidiinihelmiin vetää spesifisesti alas FOG-1:n, mikä havaitaan Western blottingilla käyttäen FOG-1-vasta-ainetta. Sitä vastoin FOG-1:tä ei voida vetää alas streptavidiinilla pelkkää BirA:ta ilmentävissä biotinyloituja ilmentävissä ydinuutteissa (oikealla). FOG-1 havaitaan dublettina (26). (B) βmaj-globiinin promoottorisekvenssien streptavidiinipulldown ristisilloitetusta kromatiinista MEL-soluista, jotka ilmentävät biotinyloitua GATA-1:tä (vasen) tai vain BirA:ta (oikea). Kolmiot osoittavat kasvavia määriä vetäytynyttä ristisilloitettua kromatiinia, jota käytetään templaattina PCR-reaktioissa βmaj-sekvenssien monistumisen havaitsemiseksi. Spesifinen rikastuminen βmaj-sekvensseille havaitaan biotinyloitua GATA-1:tä ilmentävistä soluista peräisin olevassa pulled-down-kromatiinissa, mutta ei pelkkää BirA:ta ilmentävistä soluista peräisin olevassa kromatiinissa.
Biotinylaatiomerkintä siirtogeenisissä hiirissä. Kyky eristää biotiinimerkitty proteiini suoraan raa’asta uutteesta yhdessä vaiheessa antaa mahdollisuuden käyttää tätä menetelmää merkittyjen proteiinien puhdistamiseen rajoittavista lähteistä, kuten hiiren kudoksista. Tämän vuoksi testasimme, toimisiko BirA-välitteinen biotinylaatiomerkintä myös in vivo siirtogeenisissä hiirissä. Koska GATA-1:n yliekspressio johtaa hiirillä alkion kuolevuuteen (28), testasimme tätä lähestymistapaa merkitsemällä elintärkeän erytropoieettisen transkriptiotekijän EKLF:n (29). Hiiren EKLF-cDNA merkittiin biotinylaatiomerkillä ja kaksinkertaisella hemagglutiniiniepitoopilla ja mikroinjektoitiin hiiren muniin siirtogeenisten hiirilinjojen luomiseksi. Vastaavasti transgeenisiä hiirilinjoja luotiin myös mikroinjektoimalla BirA/erythroidi-ekspressiokasettikonstruktiota. Siirtogeeniset hiirilinjat, joissa oli havaittavissa merkityn EKLF:n ja BirA:n ilmentyminen erytroidisoluissa, valittiin ja risteytettiin. Merkityn EKLF:n in vivo -biotinyloitumista arvioitiin 13,5 päivää postcoitum-alkioiden sikiön maksasta valmistetuista ydinuutteista. Western blot -analyysi anti-EKLF-vasta-aineella havaitsi endogeenisen EKLF:n sekä merkityn EKLF:n, joka visualisoitui dublettina (kuva 4, kaista 1). Sikiön maksan ydinuutteiden sitoutuminen streptavidiinihelmiin osoittaa, että vain dubletin ylin kaistale säilyy, mikä viittaa siihen, että se on biotinyloitu (kuva 4, kaistat 2 ja 3). Tämä havainto vahvistetaan koettelemalla samaa blottia streptavidiini-HRP:llä, jolloin havaitaan vain yksi kaista (kuva 4, kaistat 7 ja 9). EKLF-vasta-aineen havaitsema dubletti johtuu todennäköisesti translaation aloituskodonien erilaisesta käytöstä N-terminaalisesti fuusioidussa biotinylaatiomerkinnässä (ylin kaistale) ja välittömästi sen alapuolella olevassa kaksoishemagglutiniiniepitoopissa, joka sisältää myös aloituskodonin (alin kaistale). Tämän seurauksena vain ylin kaista, jossa on biotinylaatiomerkki, toimii BirA:n substraattina, mikä osoittaa edelleen tämän lähestymistavan in vivo -spesifisyyden. Ydinuutteiden sitoutuminen streptavidiinihelmiin osoitti myös, että merkittävä osa (≈50 %) merkitystä EKLF:stä biotinyloituu siirtogeenisten hiirten sikiön maksassa. Arvelemme, että biotinylaatiotehokkuuden ero transfektoitujen solujen ja sikiön maksan välillä (erilaisten fuusioproteiinien käytön lisäksi) saattaa heijastaa biotiinin saatavuuden in vivo -rajoitusta (biotiinia on runsaasti soluviljelymedian täydennyksenä käytettävässä FCS:ssä) tai BirA:n ilmentymistasojen eroa. Nämä tulokset osoittavat, että merkityn EKLF:n spesifinen biotinylointi bakteerin BirA:n avulla voidaan toteuttaa myös in vivo erittäin tehokkaasti siirtogeenisissä hiirissä.
Merkityn EKLF:n spesifinen biotinylaatio siirtogeenisissä hiiren alkioissa. Merkityn EKLF/BirA-kaksoistransgeenisen linjan (kaistat 1-3 ja 7-9) ja merkityn EKLF-transgeenisen linjan (kaistat 4-6) 13,5 päivän postcoitum-alkioiden sikiömaksan ydinuutteet sidottiin streptavidiinihelmiin. Merkitty ja biotinyloitu EKLF syötetyssä ydinuutteessa, sitoutumattomassa materiaalissa (supernatantti) ja sitoutuneessa materiaalissa havaittiin EKLF-vasta-aineella (vasen) tai streptavidiini-HRP:llä (oikea). EKLF:n biotinylaatio ja sitoutuminen helmiin havaitaan vain kaksoistransgeenisten alkioiden uutteissa.