Myoblastifuusion analysointi ja kvantifiointi in vitro LADD-monivärjäyksen avulla

Aikuisten luustolihaskudoksessa on satelliittisoluiksi kutsuttujen esiasteiden solujen populaatio, joka vastaa luustolihaksen korjautumisprosessista (1-3). Aktivoituneet satelliittisolut (myoblastit) vaeltavat lihastraumakohtaan, jossa ne lisääntyvät, erilaistuvat ja fuusioituvat monitumallisiksi myotubeiksi (3-5). Tämän prosessin lopullista onnistumista mitataan sillä, missä määrin paikalliset myoblastit ovat fuusioituneet terminaalisen erilaistumisen aikana.

Myoblastifuusion arvioimiseksi kokeellisesti in vitro lasketaan fuusioindeksi, joka perustuu immunofluoresenssin havaitsemiseen mikroskopoimalla. Fluoresoivasti leimattuja vasta-aineita käytetään lihassyiden rakenneproteiinien, kuten myosiinin raskaan ketjun (MyHC) ja desmiinin, havaitsemiseen, tai vaihtoehtoisesti fluoresoivasti leimattua falloidiinia voidaan käyttää F-aktiinin visualisointiin (6-9). Ytimet leimataan fluoresoivasti käyttämällä DNA:ta sitovaa yhdistettä, kuten Hoechst 33258:aa. Tämän jälkeen lasketaan joko niiden myosyyttien tuman prosenttiosuus, joissa on ≤3 ydintä (9), tai MyHC-positiivisten myotubien tuman prosenttiosuus (10). Nämä lähestymistavat ovat vakiintuneita, mutta ne edellyttävät kuitenkin laajaa ja aikaa vievää optimointia vahvan ja spesifisen signaalin tuottamiseksi kiinnostavalle antigeenille ja sitä seuraavaa fuusioanalyysia. Jos käytetään fluoresenssimerkittyjä vasta-aineita, fluoresenssimikroskoopin käyttömahdollisuus on lisävaatimus, joka ei ole käytettävissä kaikissa laitoksissa. Myöhemmin suoritettava kvantitatiivinen määritys edellyttää työlästä ja aikaa vievää lukuisten näkökenttien analysointia, jotta saadaan populaatiota edustava fuusioindeksi. Nämä rajoitukset sekä vasta-aineisiin perustuvien määritysten suhteelliset kustannukset saivat meidät kehittämään nopean ja kustannustehokkaan in vitro -määrityksen myoblastifuusion kvantifioimiseksi käyttäen laajalti saatavilla olevaa LADD Multiple Stain -värjäystä.

LADD Multiple Stain (11) on yhdistetty ydin- ja sytoplasmavärjäys, joka sisältää fuksiinia ja toluidiinisinistä (kts. #70955; LADD Research Industries, Williston, VT). Tutkimuksiamme varten tuore LADD valmistetaan siten, että se sisältää 0,365 g toluidiinisinistä (kts. #89640-5G; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ja 0,135 g fuksiinia (kts. #47860-25G; Sigma- Aldrich) 50 ml:n lopullisessa tilavuudessa 30-prosenttista etanolia. Liuos sekoitetaan, kunnes se on liuennut, ja suodatetaan sitten Whatman-suodatinpaperin (numero 4) läpi (Cat. #09-825B, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). LADD-värjäys voidaan säilyttää muovi- tai lasiastiassa huoneenlämmössä ja käyttää uudelleen. Värjättävät solut pestään fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja kiinnitetään 70-prosenttisessa etanolissa 10 minuutin ajan. Etanoli poistetaan ja lisätään 500 µl LADD-värjäystä siten, että solut peittyvät kokonaan. Soluja inkuboidaan 1 minuutin ajan, minkä jälkeen värjäys poistetaan ja solut pestään toistuvasti tislatulla vedellä, kunnes LADD lakkaa liukenemasta veteen. Tämän jälkeen solujen annetaan kuivua ja niitä säilytetään huoneenlämmössä, kunnes niitä tarkastellaan vaihekontrastivalomikroskopialla. Valaistuksen parantamiseksi katselun aikana värjättyjä soluja voidaan upottaa PBS:ään.

Tarkistaaksemme, voidaanko tätä värjäystä käyttää menestyksekkäästi myoblastifuusion visualisointiin, C2C12-soluja kasvatettiin 80-prosenttiseen konfluenssiin (kuva 1A) tavanomaisissa viljelyolosuhteissa (12). Tämän jälkeen väliaine vaihdettiin erilaistumisväliaineeseen, joka sisälsi 2 % hevosseerumia, mikä johti fuusioon myotubeiksi (kuva 1B). Onnistunut erilaistuminen vahvistettiin lisääntyneellä MyHC:n ilmentymisellä (kuva 1D) verrattuna erilaistumattomiin soluihin (kuva 1C). LADD-värjäyksen jälkeen erilaistumattomissa C2C12-myoblasteissa on vaalean violetti sytoplasma ja tummempi tuma (kuva 1E; nuoli). Erilaistumisen jälkeen myoblastien sytoplasma on kuitenkin tumman violetti (kuva 1F; nuolenkärjet), kun taas vaaleammat tumat näkyvät selvästi monitumaisen solun sisällä (kuva 1F; nuoli). Näin ollen LADD Multiple Stain -värjäyksen jälkeen havaitaan selvästi erottuvia tumia, jotka ovat yhtä helposti erotettavissa monitumaisen myotubuksen sytoplasmasta (kuva 1F), kun niitä tarkastellaan immunosytokemian jälkeisellä fluoresenssimikroskopialla (kuva 1D).

Tarkistaaksemme, voidaanko kuva-analyysin avulla mitata myoblastifuusion etenemistä, C2C12-soluja erilaistettiin 6 päivän ajan, ja LADD-värjättyjen solujen kuvat otettiin 200-kertaisella suurennoksella Olympus CKX41 -invertoidulla valomikroskoopilla (Olympus Corporation, Tokio, Japani). Odotetusti fuusioituvien myosyyttien ja myotubien määrä kasvoi selvästi jokaisena seuraavana erilaistumispäivänä (kuva 2A). Tämän jälkeen laskettiin fuusioindeksi, ja erilaistuvien myoblastien nähtiin lisäävän fuusioindeksiään asteittain 0,45 prosentista (päivä 1) 31,4 prosenttiin (päivä 6) (kuva 2B). Tällä tavoin johdettu fuusioindeksi on hyvä verrattuna indeksiin, joka on laskettu käyttämällä tavanomaista immunosytokemiaa (MyHC:n havaitsemiseksi) ja ydinvärjäystä (13). Sen määrittämiseksi, voitaisiinko ImageJ-analyysiohjelmistoa (https://imagej.nih.gov/ij/) mukauttaa myofibereiden pinta-alan kvantifiointiin (fuusion mittarina), kehitettiin makro ja testattiin sitä kuvassa 2A esitetyillä kuvilla. Makro asetetaan seuraavasti ja tallennetaan:

• Avaa ImageJ ja napsauta ”Plugins = > Macros = > Startup Macros”

• Korvaa olemassa oleva teksti lisätaulukossa S1 esitetyllä koodauksella.

Kuvat avataan ImageJ:ssä ja makro ajetaan napsauttamalla ”Macros = > Run Macro”. Tämä analysoi kuvat yksi kerrallaan. Käyttäjän on varmistettava, että kynnysarvo on asetettu oikein; vain myofibin alue on analysoitava. Värikynnystä voidaan muuttaa muokkaamalla makron riviä ”setThreshold(0,130)”; suurentamalla toista lukua otetaan mukaan enemmän kevyesti värjäytyneitä alueita, kun taas useampia alueita jätetään pois, kun tätä lukua pienennetään. Tätä menetelmää käyttäen myofibereiden pinta-ala saavutti 29,6 prosenttia päivänä 6 (kuva 2C), mikä vastaa hyvin samalle ajankohdalle laskettua fuusioindeksiä (kuva 2B). Jenner- ja Giemsa-väriaineita voidaan käyttää myös myotubien värjäämiseen valomikroskopiaa varten pitkälti samalla tavalla kuin LADD:tä, mutta värjäys LADD:llä on kuitenkin monta kertaa nopeampaa, ja kehittämämme ImageJ-makro mahdollistaa paremman kontrollin siitä, mitkä alueet mitataan (14).

Validoidaksemme edelleen LADD-monivärjäyksen käyttöä fuusioanalyysiin, C2C12-soluja erilaistettiin 5 päivän ajan 10 µM BB94:n (Cat. #ab142087; Abcam, Cambridge, UK) läsnäollessa tai poissaollessa, ja sen jälkeen ne kiinnitettiin ja värjättiin LADD:llä aiemmin kuvatulla tavalla. BB94 on kaupallisesti saatavilla oleva synteettinen matriksin metalloproteaasin estäjä, jonka on aiemmin osoitettu vähentävän myoblastien fuusioitumista (15,16). BB94:n läsnä ollessa fuusioindeksi laski merkittävästi 50 prosentista (DMSO-kontrolli) 22 prosenttiin (P < 0.05) (kuva 2D); myofibrojen pinta-alan analyysi paljasti saman suuntauksen, jossa fuusio väheni 46 prosentista (DMSO-kontrolli) 21 prosenttiin (P < 0.05) BB94:n läsnäollessa (kuva 2E).

Tässä esittelemme nopean, uudenlaisen menetelmän sekä myofibirakenteen että siihen liittyvien myonisolujen värjäämiseen LADD Multiple Stain -värjäyksen avulla. ImageJ:tä käytetään sen jälkeen lihassyiden pinta-alan tarkkaan arviointiin fuusion mittana. LADD:n suhteellisen alhaiset kustannukset ja käsittelyyn ja analyysiin tarvittava huomattavasti lyhyempi aika merkitsevät sitä, että fuusio voidaan nyt analysoida nopeasti tavallisessa laboratoriossa ilman immunosytokemiaa ja fluoresenssimikroskopiaa.

.