Nordiatsepaamin hapan muuntuminen voi vaikuttaa talteenottoarvioon analysoitaessa diatsepaamin ja nordiatsepaamin jäämiä ympäristön vesinäytteistä nestekromatografia-tandemmassaspektrometrialla

Nestekromatografia-tandem-kvadrupolimassaspektrometrialla

Kehitetyillä isokraattisilla sekä gradienttieluutiojärjestelmillä saatiin hyvä piikin erottelukykyinen tulostustulos (Rs ≥ 3,1) diatsepaamin ja nordiatsepaamin osalta. Isokraattisessa järjestelmässä nordiatsepaami-d5- ja diatsepaami-d5-standardien retentioajat olivat 2,6 min (0,54 RSD %) ja 4,1 min (0,27 RSD %). Pintavesimatriisissa retentioajat olivat samat kuin standardeilla, ja RSD-arvot olivat 0,62 % nordiatsepaami-d5:lle ja 0,30 % diatsepaami-d5:lle. Työskentelystandardien retentioajat gradienttijärjestelmässä olivat nordiatsepaamille 2,4 minuuttia (0,90 RSD-%) ja diatsepaamille 2,9 minuuttia (0,70 RSD-%). Käsitellyn jäteveden yhdisteiden retentioaikojen tarkkuus on esitetty taulukossa 1, jossa RSD-arvot olivat ≤ 0,35 %.

Diatsepaami ja nordiatsepaami tunnistettiin käsitellyistä jätevesinäytteistä niille ominaisten MS/MS-siirtymien ja retentioaikojen perusteella (taulukko 1). Kullekin yhdisteelle seurattiin yksi esiasteioni ja kaksi fragmentti-ionia. Luonnossa esiintyvien diatsepaamin ja nordiatsepaamin tunnistamiseksi verrattiin kahdesta fragmentti-ionista saatujen piikkien pinta-alojen suhteita standardien pinta-aloihin (taulukko 1). Myös kohdeyhdisteiden retentioaikoja verrattiin diatsepaami-d5:n ja nordiatsepaami-d5:n retentioaikoihin samassa kromatografia-ajossa.

Kiinteän faasin uuttomenetelmän kehittäminen

Diatsepaamin ja nordiatsepaamin stabiilisuus happamissa ja neutraaleissa vesinäytteissä

Kerätyt ympäristövesinäytteet säilötään tavallisesti happamissa pH:n lämpötiloissa, ennen kuin ne analysoidaan nousevien epäpuhtauksien määrityksessä . Tässä tutkimuksessa tutkittiin diatsepaamin ja nordiatsepaamin stabiilisuutta, kun niitä säilytettiin työskentelystandardeina (pH 3,1 ja pH 7,0). Todettiin, että nordiatsepaami hajosi laajalti, kun sitä säilytettiin happamassa liuoksessa huoneenlämmössä. 12 päivän kuluessa 56 % nordiatsepaamista oli hajonnut (kuva 2). Hajoaminen ei ollut yhtä laajaa, kun käyttöliuosta säilytettiin 4 °C:ssa; 12 päivän kuluttua 20 % nordiatsepaamin alkuperäisestä pitoisuudesta oli hajonnut. Toisaalta diatsepaamin todettiin olevan stabiili pH:ssa 3,1, kun sitä säilytettiin huoneenlämmössä ja 4 °C:ssa (kuva 2). Vain 0,53 % ja 3,1 % diatsepaamista hajosi 12 päivän aikana huoneenlämmössä ja 4 °C:ssa. Molemmat yhdisteet osoittautuivat stabiileiksi 12 päivän ajan neutraalissa pH:ssa. Päivässä 12 diatsepaamin ja nordiatsepaamin vasteet (säilytettäessä 4 °C:ssa ja huoneenlämmössä) olivat 101-103 % alkuperäisistä vasteista. Määritetyn pitoisuuden RSD-arvot (n = 3) eri ajankohtina olivat ≤ 5,1 %. Reaktio havaittiin alun perin jätevesinäytteissä, mutta kokeet suoritettiin valmistetuissa liuoksissa olosuhteiden yksinkertaistamiseksi ja muiden reaktioiden/vaikutusten mahdollisuuden vähentämiseksi jäteveden hyvin monimutkaisissa matriiseissa.

Diatsepaamin ja nordiatsepaamin stabiilisuus 5 mM muurahaishapossa puhdistetussa vedessä, pH 3. Diatsepaami varastoituna 4 °C:ssa (valkoinen kolmio) ja huoneenlämmössä (musta kolmio). Nordiatsepaami säilytettynä 4 °C:ssa (valkoinen neliö) ja huoneenlämmössä (musta neliö). Kokeelliset yksityiskohdat on kuvattu kohdassa ”Stability studies of diazepam and nordiazepam in acidic and neutral aqueous solutions”

Tuloksemme osoittavat, että nordiatsepaami on epästabiili pH:ssa 3. Nämä tulokset ovat kirjallisuudessa esitettyjen tulosten mukaisia, joiden mukaan nordiatsepaami hydrolysoituu happamissa liuoksissa. Archontaki et al. havaitsivat, että nordiatsepaami hydrolysoitui happamissa vesiliuoksissa ja että hajoamisen ensimmäinen vaihe oli palautuva. Tämän tutkimuksen havainnot voivat kuitenkin vaikuttaa ristiriitaisilta tuoreen tutkimuksen tulosten kanssa, jossa todettiin, että nordiatsepaami (ja diatsepaami) olivat vakaampia pH 2:ssa kuin pH 7:ssä. Ero on itse asiassa odotettavissa, kun otetaan huomioon erilaiset saannon määritysstrategiat. Koska nordiatsepaamin muuntuminen palautuu haihdutuksen ja kuumentamisen aikana, menetelmän rutiinikäytön kannalta sillä ei välttämättä ole käytännön vaikutuksia. Vasta kun saanto arvioidaan Matuszewskin ym. suositusten mukaisesti yhdistettynä nordiatsepaamin epästabiilisuuteen alhaisessa pH:ssa, saadaan yhdisteen häviö ja siten näennäisesti korkea saanto.

Simuloitujen ympäristövesinäytteiden kiinteäfaasiuuton saannot simuloitujen ympäristövesinäytteiden osalta, jotka varastoitiin alhaisessa näytteen pH:ssa

Kiinteäfaasiuuton saannot ja matriisivaikutus määritettiin käsitellyistä vesinäytteistä LC-MS:llä Matuszewskin ym. suositteleman menetelmän avulla, jonka yksityiskohdista kerrotaan kohdassa ”Menetelmän validointi”. Uuttotulokset määritettiin isotooppimerkityille standardeille, diatsepaami-d5:lle ja nordiatsepaami-d5:lle, koska leimattuja yhdisteitä ei odoteta löytyvän ympäristömatriiseista. Tässä tutkimuksessa diatsepaami-d5:n ja nordiatsepaami-d5:n työskentelystandardit säilytettiin 5 mM muurahaishapossa puhdistetussa vedessä pH 3,1/asetonitriili (90/10, v/v) enintään viikon ajan 8 °C:ssa, ja niitä käytettiin sarjojen A-C valmistamiseen.

Taulukossa 2 esitetään suhteelliset uuttamissaavutukset, jotka on määritetty yhdelle matalalle konsentraatiolle ja yhdelle korkealle konsentraatiolle (uuttamismenetelmää selostetaan kohdassa ”Näytteen valmistelu ja kiinteäfaasiuutto”). Uuttotulokset olivat suuremmat nordiatsepaami-d5:lle kuin diatsepaami-d5:lle. Nordiatsepaami-d5:n suhteelliset uuttotulokset olivat 114 ± 8,1 % ja 117 ± 21 % alhaisella ja korkealla pitoisuudella. Diatsepaami-d5:lle saadut RSD-arvot olivat 6,0 % alhaisella ja 24 % korkealla pitoisuudella (taulukko 2). Kiinteän faasin uuttomenetelmän RSD-arvot ovat toisinaan korkeita (≥ 18 %), kun määritetään jälkiä monimutkaisissa matriiseissa. Lisäksi kirjallisuudessa on aiemmin raportoitu suuria uuttotuloksia (≥ 100 %) nordiatsepaamille ympäristön vesinäytteistä. Kuten jäljempänä käsitellään, korkeat saaliit saattavat korreloida nordiatsepaamin ja muunnostuotteen väliseen kemialliseen tasapainoon.

Nordiatsepaami-d5:n absoluuttiseksi uuttamissaantumaksi määritettiin 139 ± 21 % ja matriisivaikutukseksi 119 ± 3,0 %. Nordiatsepaami-d5:n korkea absoluuttinen uuttotulos selittyy osittain sillä, että nordiatsepaami-d5:lle tapahtui ionivahvistus MS-rajapinnassa. Osoitimme kuitenkin, että korkeat uuttotulokset (> 100 % suhteellisessa uutossa, kuten edellä käsiteltiin) eivät johtuneet ainoastaan matriisivaikutuksista ESI-lähteessä. Tämä todettiin Matuszewskin ym. mukaan saaduista suhteellisista uuttotuloksista, joissa uutetut ja ei-uutetut näytteet ruiskutettiin LC-MS/MS-järjestelmään samaan matriisiin liuotettuna. Sen varmistamiseksi, että korkeat uuttotulokset eivät liittyneet mihinkään massaspektrometrin rajapinnassa tapahtuvaan prosessiin, diatsepaami-d5:n ja nordiatsepaami-d5:n uuttotulokset määritettiin käyttämällä toista detektiotekniikkaa, LC-UV:tä. Yhden fosfaattipuskurissa (pH 7,0) olevan nordiatsepaami-d5:n uutetun näytteen talteenotto, joka analysoitiin sekä LC-MS/MS:llä että LC-UV:llä, oli 159 ja 153 prosenttia (n = 2). Päättelimme, että nordiatsepaamin korkeat uuttotulokset eivät johtuneet suurelta osin mistään massaspektrometrissä tapahtuneesta prosessista.

Johtopäätöksenä voidaan todeta, että vaikka saadut uuttotulokset ja RSD-arvot olivat korkeita, ne vaikuttavat luultavasti kohtuullisilta, koska kohdeyhdisteiden pitoisuudet olivat alhaisia (50 ja 250 pM) ja koska yhdisteet uutettiin monimutkaisesta matriisista. Tässä tutkimuksessa halusimme osoittaa, että nämä nordiatsepaamille saadut korkeat talteenotot voisivat korreloida nordiatsepaamin ja muunnostuotteen väliseen kemialliseen tasapainoon, jonka Archontaki et al. havaitsivat.

Nordiatsepaamin regeneraatio näytteen valmistuksen aikana

Kun diatsepaamin ja nordiatsepaamin varastoidut liuokset (pH 3.1, huoneenlämpötilassa, ”Diatsepaamin ja nordiatsepaamin stabiilisuus happamissa ja neutraaleissa vesinäytteissä”) käytettiin fosfaattipuskurin piikittämiseen ja sen jälkeen suoritettiin kiinteäfaasiuutto, nordiatsepaamin rekonstruoiduista uutteista saadut vasteet olivat suurempia verrattuna vasteisiin, jotka saatiin uuttamattomista säilytetyistä liuoksista. Kiinteäfaasiuutolla nordiatsepaamin piikin pinta-ala oli kasvanut 26 pinta-alasta (2,7 RSD-%, n = 3) 45 pinta-alaan (14,6 RSD-%, n = 3).

Varmistaaksemme, että nordiatsepaami regeneroitui kiinteän faasin uuton aikana, yksi tallennettu näyte nordiatsepaami-d5:stä (jonka fragmentti-ionin m/z 213 piikin pinta-ala oli 1470) ja yksi prosessoitu näyte nordiatsepaami-d5:stä (jonka piikin pinta-ala oli 1790) injektoitiin LC-MS/MS-järjestelmään. Nordiatsepaami-d5:n SRM-kanavan (276 → 213) lisäksi hankittiin kaksi muuta SRM-kanavaa, taulukko 1. Tallennetut nordiatsepaami-d5-näytteet injektoitiin (n = 6), ja SRM-siirtymien suhteiksi määritettiin 1,4 (3,8 RSD-%, fragmentti-ionisuhde m/z (276 → 213)/(276 → 165) ja 1,0 (3,5 RSD-%, fragmentti-ionisuhde m/z (276 → 213)/(276 → 140). Käsitellyssä nordiatsepaami-d5-näytteessä SRM-siirtymien suhteet olivat samat eli 1,4 ja 1,0. Näin ollen fragmentti-ionien suhteissa ei ollut merkittäviä eroja varastoitujen ja prosessoitujen näytteiden välillä. Lisäksi retentioajat olivat samat molemmissa näytteissä. Johtopäätöksenä oli, että sekä varastoidussa että prosessoidussa näytteessä havaittiin nordiatsepaami-d5.

Archontaki et al. havaitsivat, että nordiatsepaami muuntui happamassa vesiliuoksessa välituotteeksi N-(2-bentsoyyli-4-kloorifenyyli)-2-aminoasetamidiksi, jonka molekyylikaava on C15H13N2O2Cl ja monoisotooppinen massa 288,1 Da. Muuntotuote kiteytettiin ja analysoitiin LC-UV:llä, GC-MS:llä, 1H- ja 13C-NMR:llä sekä IR-spektroskopialla. Välituotteen ja nordiatsepaamin kemiallinen tasapaino oli palautuva, mutta välituotteen edelleen muuttuminen lopulliseksi hajoamistuotteeksi (C13H10NOCl) ei kuitenkaan ollut palautuva. Tässä tutkimuksessa nordiatsepaamin varastoidussa liuoksessa (pH 3,1) havaittiin LC-MS:llä ioni, jonka retentioaika oli 3,0 minuuttia ja massa-lataussuhde 289,0. Tämä ioni saattaa vastata nordiatsepaamin muunnostuotetta +. Lisäksi ionin isotooppikuvio 3,0 minuutin kohdalla vastasi yhden klooriatomin isotooppikuviota. Lisäksi kromatografinen piikki eluoitui ennen nordiatsepaamia, mikä vastaa tuloksia, jotka saatiin nordiatsepaamin ja N-(2-bentsoyyli-4-kloorifenyyli)-2-aminoasetamidin erottelusta käänteisfaasijärjestelmässä, jota Archontaki et al. käyttivät. Näin ollen varastoidussa happamassa vesiliuoksessa havaittu piikki oli tässä tutkimuksessa todennäköisesti N-(2-bentsoyyli-4-kloorifenyyli)-2-aminoasetamidi. Lisäksi nordiatsepaamin ja N-(2-bentsoyyli-4-kloorifenyyli)-2-aminoasetamidin piikin pinta-alojen suhde oli 0,75 (n = 2) tässä varastoidussa vesiliuoksessa tässä tutkimuksessa. Haihdutetuissa metanoliseoksissa (kokeelliset yksityiskohdat on kuvattu kohdassa ”Stability studies of diazepam and nordiazepam in acidic and neutral aqueous solutions”) nordiatsepaamin ja N-(2-bentsoyyli-4-kloorifenyyli)-2-aminoasetamidin piikin pinta-alasuhde nousi kuitenkin 1,9:ään (6,8 RSD-%, n = 4), ts, nordiatsepaamin piikin pinta-ala kasvoi ja N-(2-bentsoyyli-4-kloorifenyyli)-2-aminoasetamidin piikin pinta-ala pieneni verrattuna näytteeseen, jota ei haihdutettu. Nollanäytteessä ei havaittu N-(2-bentsoyyli-4-kloorifenyyli)-2-aminoasetamidin tai nordiatsepaamin piikkejä. Nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että nordiatsepaamin ja Archontaki et al. luonnehtiman nordiatsepaamin muunnostuotteen kemiallinen tasapaino siirtyi N-(2-bentsoyyli-4-kloorifenyyli)-2-aminoasetamidista nordiatsepaamiksi SPE-uutteiden haihduttamisen aikana. Mitään piikkiä ei havaittu, joka voitaisiin korreloida nordiatsepaamin lopullisen hajoamistuotteen (C13H10NOCl) kanssa.

Johtopäätöksenä oli, että nordiatsepaami muuntui helposti N-(2-bentsoyyli-4-kloorifenyyli)-2-aminoasetamidiksi happamassa vesiliuoksessa. Mielenkiintoista oli, että nordiatsepaami regeneroitui kiinteän faasin uuttoprosessin aikana. Näin ollen käytettäessä pH 3,0:ssa varastoituja nordiatsepaamiliuoksia referenssinä uuttamissa saatujen saantojen laskennassa uuttamissa saadut saannot ovat yliarvioituja. Näillä tuloksilla on merkitystä menetelmän validoinnissa eli varastointiolosuhteiden, uuttotulosten ja matriisivaikutusten arvioinnissa. Lisäksi nordiatsepaamin muuntuminen saattaa vaikuttaa analyyttisiin kokonaistuloksiin, jos sisäisenä standardina ei käytetä nordiatsepaamin isotooppimerkittyä analogia. On myös korostettava, että nordiatsepaamin muuntuminen saattaa vaikuttaa menetelmän tarkkuuteen paitsi kiinteäfaasiuuttoa edeltävän varastoinnin aikana myös riippuen käytetyn liuoksen pH:sta, esimerkiksi kuivattujen SPE-uutteiden rekonstruoinnissa.

Menetelmän validointi

Kehitetty menetelmä validoitiin käyttämällä isotooppimerkittyjä analogeja, diatsepaami-d5:tä ja nordiatsepaami-d5:tä (”Menetelmän validointi”), koska näitä yhdisteitä ei havaittu ympäristönäytteissä. Leimattujen analogien käyttämisen etuna menetelmän validoinnissa on se, että menetelmä voidaan validoida jäljityspitoisuuksilla todellisessa matriisissa, jossa analyytit kvantifioidaan. Diatsepaami-d5:n ja nordiatsepaami-d5:n suhteelliset uuttotulokset käsitellyissä jätevesinäytteissä olivat ≥ 87 % suurilla ja pienillä pitoisuuksilla (taulukko 3). Saadut arvot ovat sen luokkaa, mitä voidaan odottaa, kun lääkeaineiden hivenainepitoisuuksia uutetaan monimutkaisista matriiseista . Absoluuttiset uuttotulokset olivat alhaisemmat, 63-86 prosenttia, koska analyytit joutuivat ionisuppressioon (taulukko 3). Pienillä pitoisuuksilla matriisivaikutukset (ME-%) olivat 76 ± 14 % diatsepaami-d5:n ja 88 ± 14 % nordiatsepaami-d5:n osalta (taulukko 3). Suurella pitoisuudella matriisivaikutus ja RSD-arvot olivat samaa luokkaa kuin pienellä pitoisuudella. Nämä ME-%:n luvut ovat hyväksyttävällä alueella, sillä muista tutkimuksista saadut tulokset osoittavat, että ympäristöveden matriiseilla saatu matriisivaikutus voi olla suhteellisen suuri. Menetelmän tarkkuus määritettiin määrittelemällä SPE:n saanto diatsepaami-d5:n ja nordiatsepaami-d5:n alhaisilla ja korkeilla pitoisuuksilla (taulukko 3). Suhteelliset talteenotot olivat 88 ± 7,6 % ja 87 ± 12 % diatsepaami-d5:n osalta matalalla ja korkealla pitoisuudella ja 98 ± 7,8 % ja 99 ± 6,1 % nordiatsepaami-d5:n osalta.

Kromatografisen järjestelmän tarkkuus, ilmaistuna diatsepaami-d5:lle ja nordiatsepaami-d5:lle uutetuissa jätevesinäytteissä saatujen retentioaikojen RSD-arvoina, oli ≤ 0,62 %. Diatsepaami-d5:n ja nordiatsepaami-d5:n piikkipinta-alojen RSD-arvot uutetuissa jätevesinäytteissä olivat ≤ 7,8 % (”Nestekromatografian tandemkvadrupolimassaspektrometriajärjestelmät”). Lisäksi lineaarisuus, ilmaistuna kalibrointikäyrien korrelaatiokertoimena (R2) käsitellyissä jätevesinäytteissä, oli diatsepaamin osalta 0,988 ja nordiatsepaamin osalta 0,957.

Tässä tutkimuksessa ei havaittu kulkeutumista nestemäisen magneettitutkimusjärjestelmän (LC-MS/MS) järjestelmässä, sillä yhdessäkään injektoiduista puhdistetusta Millipore-vesinäytteestä ei havaittu mitään piikkejä, joissa olisi ollut analyyttejä tai isotoopilla leimattuja yhdisteitä. Mikään ei viitannut siihen, että näytteen käsittelyn tai kiinteän faasin uuton aikana olisi tapahtunut ristikontaminaatiota, sillä uutetut fosfaattipuskurinäytteet eivät sisältäneet kohdeyhdisteitä. Riski väärien positiivisten löydösten saamisesta itsekontaminaation seurauksena katsottiin siksi minimoiduksi tässä tutkimuksessa.

Diatsepaami-d5:n ja nordiatsepaami-d5:n LOQ- ja LOD-arvot määritettiin käsitellyistä jätevesinäytteistä. Määritysrajoiksi asetettiin 5,0 pM (1,4 ng L-1 ) sekä diatsepaami-d5:lle että nordiatsepaami-d5:lle, jolloin signaali-kohinasuhde oli noin 10 ja saatu tarkkuus oli 12,7 ja 15,9 RSD-% (n = 3) kyseisille yhdisteille (taulukko 3), eli säädetyn 20 prosentin tarkkuuden sisällä . Tässä tutkimuksessa saadut LOQ-arvot ovat samaa luokkaa kuin mitä muissa tutkimuksissa on saavutettu diatsepaamin ja nordiatsepaamin osalta käsitellyissä jätevesinäytteissä. Kyseisessä tutkimuksessa käsitellystä jätevedestä uutettiin kuitenkin 200 millilitraa, kun taas esitetyssä menetelmässä uutettiin 75 millilitraa. Diatsepaami-d5:n havaitsemisraja oli 1,7 pM (0,49 ng L-1) ja nordiatsepaami-d5:n havaitsemisraja 2,0 pM (0,55 ng L-1) (taulukko 3).

Kuten edellä käsiteltiin (”Diatsepaamin ja nordiatsepaamin stabiilisuus happamissa ja neutraaleissa vesipitoisissa näytteissä”, kuva 2), osoitettiin diatsepaamin ja nordiatsepaamin pysyvän stabiileina 12 vuorokauden ajan näytteen pH:n ollessa 7.0, kun niitä säilytettiin huoneenlämmössä tai 4 °C:ssa.

Diatsepaamin ja nordiatsepaamin kvantitatiivinen määritys ympäristön vesinäytteistä

Kehitettyä LC-MS/MS-menetelmää sovellettiin ympäristön vesinäytteisiin diatsepaamin ja nordiatsepaamin määrittämiseksi. On korostettava, että kehitettyä menetelmää voidaan käyttää diatsepaamin ja nordiatsepaamin määrittämiseen ympäristönäytteistä happamissa olosuhteissa, jos näytteisiin lisätään ennen varastointia ihanteelliset sisäiset standardit eli kohdeyhdisteiden isotooppimerkityt yhdisteet. Tässä tutkimuksessa käytettiin sisäisinä standardeina isotooppimerkittyjä yhdisteitä, diatsepaami-d5:tä ja nordiatsepaami-d5:tä, joilla kompensoitiin yhdisteiden mahdollinen muuntuminen ja muut häviöt sekä vaihtelut analyysin aikana.

Käsitellyistä jätevesi- ja pintavesinäytteistä analysoitiin diatsepaami ja nordiatsepaami. Standardiliuoksista saatujen ionisuhteiden (taulukko 1) ja ”luonnossa” esiintyvälle diatsepaamille tai nordiatsepaamille saatujen ionisuhteiden välillä ei ollut merkittäviä eroja 5 %:n tasolla t-testissä (P ≥ 0,07). Diatsepaamin ja nordiatsepaamin pitoisuuksiksi määritettiin 8,5 (2,4 ng L-1) ja 66 pM (18 ng L-1). Samasta jätevedenpuhdistamosta 14 päivää myöhemmin kerätyissä näytteissä diatsepaamin ja nordiatsepaamin pitoisuudet olivat 7,5 (2,1 ng L-1) ja 75 pM (20 ng L-1). Näin ollen nordiatsepaamin pitoisuudet määritettiin noin yhden kertaluokan suuremmiksi kuin diatsepaamin pitoisuudet. Nämä tulokset ovat samansuuntaisia kuin muissa jätevesipäästöjä koskevissa tutkimuksissa saadut tulokset. Lisäksi joistakin käsitellyistä jätevesinäytteistä, joista on raportoitu kirjallisuudessa, määritettiin määrällisesti nordiatsepaamia, mutta diatsepaamia ei havaittu. Tässä tutkimuksessa diatsepaamia tai nordiatsepaamia ei havaittu pintavedessä, joka kerättiin Fyrisjoesta, 3 km ylävirtaan Kungsängsverketin jätevedenpuhdistamolta, mikä viittaa siihen, että ihmisperäisiä jätevesipäästöjä ylävirtaan on vähän.