Tn5-mutanttikirjaston rakentaminen
Tn5-mutantit tuotettiin satunnaismutageneesillä käyttäen virhealtista PCR:ää koko villityypin Tn5-transposaasiin (NCBI:n liittymäkoodi ”3ECP_A”, Additional file 1). Kohteen kyllästäminen suoritettiin proteiinin mallinnetulle DNA:n sitoutumiskohdalle. Mutagenisoidut Tn5-fragmentit lisättiin muunnettuun pET11a-vektoriin E. coli -bakteerissa (Illumina Madison) tapahtuvaa ekspressiota varten. Vektori on kanamysiiniresistentti plasmidin stabiilisuuden vuoksi, ja siinä on Strep Tag II-sumofuusio T7-promoottorin/lac-operonin alapuolella Tn5:n koodaavan alueen N-terminaalissa puhdistuksen helpottamiseksi. Lineaarisella regressiolla tunnistetut ajurimutaatiot yhdistettiin tavanomaisella site-directed mutagenesis -menetelmällä (Qiagen).
Mutanttiproteiinin ilmentyminen ja puhdistus
Mutanttikirjastoa kasvatettiin, yksittäiset pesäkkeet valittiin inokuloimaan 1 L Luria Broth (LB) -mediaa, jossa oli 50 μg/mL kania, ja niiden annettiin kasvaa OD600:een = 0,5. Tn5-mutanttien transposaasien ilmentyminen indusoitiin sitten lisäämällä 100 μM isopropyyli β-D-1-tiogalaktopyranosidia (IPTG) ja jatkamalla inkubointia 18 °C:ssa 19 tuntia.
Solut kerättiin sentrifugoimalla ja resuspendoitiin TNE1-puskuriin (100 mM Tris, pH 8,0, 1 M NaCl, 1 mM etyleenidiamiinitetraetikkahappo (EDTA), 1 mM ditiotiotreitoli (DTT)), joka sisälsi täydellisen proteaasi-inhibiittorisekoituksen (Roche). Solupelletti hajotettiin lasihomogenisaattorilla ennen kuin se johdettiin mikrofluidisaattorin läpi kolme kertaa lyysiä varten. Lysaattiin lisättiin natriumdeoksikolaattia (0,1 % lopullinen) ja seosta inkuboitiin huoneenlämmössä sekoittaen 15 minuutin ajan ja sen jälkeen 15 minuuttia 4 °C:ssa. Sekoitettaessa 4 °C:ssa seokseen lisättiin 5 % polyetyleenimiinia, pH 7,5 (0,5 % lopullinen), ja sitä sekoitettiin edelleen 1 tunnin ajan nukleiinihappojen saostamiseksi, jotka poistettiin sentrifugoimalla (45 000 g 20 minuutin ajan 4 °C:ssa). Supernatanttiin lisättiin kyllästettyä ammoniumsulfaattia suhteessa 1:1 ja seosta sekoitettiin 4 °C:ssa 1 h ja sentrifugoitiin (45 000 g 20 minuutin ajan 4 °C:ssa). Tn5-mutanttiproteiineja sisältävä pelletti suspendoitiin uudelleen 10 ml:aan TNE1:tä, sentrifugoitiin hiukkasten poistamiseksi ja saatu supernatantti laimennettiin edelleen 5 × TNE1:llä ja ladattiin StrepTrap High Performance (HP) -kolonniin (GE Healthcare), joka tasapainotettiin TNE1:llä käyttäen AKTA Purea (GE Healthcare).
Latauksen jälkeen StrepTrap HP -kolonni pestiin 10:llä kolonnitilavuudella (CV) 100 mM Tris, pH 8.0, 4 M NaCl, 1 mM EDTA ja sen jälkeen 10:llä CV:llä 100 mM Tris, pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA. Proteiini eluoitiin sitten 10 CV:n gradientilla, jossa käytettiin 100 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM Desthiobiotin (IBA-lifesciences). Fraktiot, jotka sisälsivät piikkejä OD280:ssa, yhdistettiin ja levitettiin HiTrap Heparin HP -kolonniin, joka oli tasapainotettu 100 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,2 mM EDTA (GE Healthcare). Sitoutumisen jälkeen pylväs pestiin 15 CV:n tasauspuskurilla, jota seurasi 20 CV:n suolagradientti (100 mM-1 M NaCl). Natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE) osoitettiin, että 0,5 M NaCl:lla eluoitunut yksittäinen piikki sisälsi 66 kDa:n Strep-Sumo-Tn5-mutaatioita. Eluoitunut piikki konsentroitiin Vivaspin 20 -sentrifugikonsentraattorilla, jonka MWCO on 10 kDa, ja laimennettiin sitten 1:1 100-prosenttisella glyserolilla säilytystä varten -20 °C:ssa. Tämän ilmentämisen ja puhdistuksen perusteella Tn5-mutanttien transposaasien saanto oli noin 5 mg 1 litran viljelyä kohti.
Transposomien kokoaminen ja aktiivisuuden normalisointi
19 bp:n Tn5-mosaic end (ME) -transposonisekvenssi (joka sisälsi myös 14 ja 15 bp:n 5′-adapterisekvenssin, joka oli yhteensopiva Illuminan pareittaisen sekvensoinnin kanssa) annealoitiin lämmittämällä yksisäikeisiä oligoja 95 °C:n lämpötilassa 5 minuutin ajan ja alentamalla lämpötilaa sitten 5 °C:lla 2 minuutin välein 20 °C:een. Annealoidut ME:t yhdistettiin puhdistettuihin Tn5-transposaaseihin moolisuhteessa 1,2:1 (ME:transposaasi) ja inkuboitiin 37 °C:ssa 1 h. Tuloksena syntynyt transposomikokoonpano säilytettiin -20 °C:ssa käyttöön saakka.
Kunkin mutantin tagmentaatioaktiivisuus normalisoitiin Nextera-dna-kirjastojen valmistelumenetelmässä määritellyllä vakiomenetelmällä ja käyttämällä Nextera DNA-kirjaston valmistelumenetelmässä määriteltyä standardimenetelmää ja reagensseja (Illumina). Lyhyesti sanottuna 25 ng B. cereus -genomista DNA:ta (gDNA) tagmentoitiin eri pitoisuuksilla mutantteja tai standardilla Tn5:llä Illumina Nextera kitistä kontrollina. Tuloksena saadun fragmentoidun DNA:n koko analysoitiin Agilentin High Sensitivity DNA bioanalyzer -sirulla. Tn5-mutanttien pitoisuudet normalisoitiin sen jälkeen siten, että saavutettiin sama DNA-fragmenttien kokojakauma, jossa käyrän alle jäävä pinta-ala 100-300 bp:n välillä oli 20-30 %, 301-600 bp:n välillä 30-40 % ja 601-7000 bp:n välillä 30-40 %, kun taas käyrän alle jäävä kokonaispinta-ala 100-7000 bp:n välillä oli ≥90 % (lisätiedosto 2: kuva S1).
DNA-kirjastojen valmistaminen, sekvensointi ja data-analyysi
5 μl kutakin Tn5-mutantin transposomia normalisoidussa konsentraatiossa käytettiin sekvensointikirjastojen valmistamiseen E. coli gDNA:lle (tasapainoinen genomi), R. sphaeroidesille (GC-rikas genomi) ja B. cereus -genomisen DNA:n (AT-rikas genomi) sekvensoimiseksi Nextera-DNA-kirjastojen valmistuksen standardimenetelmällä. Kirjastot sekvensoitiin sitten MiSeqillä Illuminan standardiprotokollan mukaisesti. Bias-plotit luotiin laskemalla, kuinka monta kertaa kukin nukleotidi havaittiin kussakin syklissä kaikkien lukujen osalta, ja ilmoittamalla se prosentteina. Bias plot osoittaa transposaasin yleisen tagmentaatioharhan. Huomaa, että bias kussakin kohdassa voi olla riippumaton muista kohdista. Kattavuuskaaviot osoittavat eri sekvensointisyvyyksillä havaittujen emästen prosenttiosuuden. Ne luotiin käyttämällä samtoolsin mpileup-optiota (http://www.htslib.org/). Normalisoidut GC-käyrät ja AT/GC-pudotukset luotiin käyttämällä Picard Tools -ohjelmaa (http://broadinstitute.github.io/picard/).
Lineaarinen regressio
Lineaarisia regressiomalleja käytettiin arvioimaan kunkin yksittäisen mutaation painoarvoa insertion biasissa. Kutakin lineaarista regressiomallia sovellettiin lukujen emäspaikan dominoivan nukleotidin sisältöön, jolloin saatiin malli emäspaikkaa kohti. Mallien sovittamiseen käytettiin E. coli -sekvensointituloksia. Näin ollen seuraavia nukleotideja käytettiin dominoivana nukleotidina emäspaikkojen 1 ja 15 välillä: GTTTA***CTGTGCG. Koska Tn5 toimii homodimeerinä, asemissa 6-9 havaitut dominoivat nukleotidit ovat aina komplementtiperustoja asemissa 1-4 olevien nukleotidien kanssa. Siksi jätimme emästen 6, 7 ja 8 mallit huomiotta, mutta säilytimme emäspaikan 9. Vaikka asema 9 toistaa aseman 1 käyttäytymistä symmetrian vuoksi, asemaan 1 vaikuttavat sekvensointiartefaktit, joten käytämme asemaa 9, jotta aseman 1 ominaisuudet saadaan paremmin taltioitua.
Koulutuksessa käytettiin kymmenkertaista ristiinvalidointia, ja painotukset keskiarvoistettiin 10 ristiinvalidointikierroksen aikana. Ennustemuuttujien syöttömatriisi koostui kunkin mutantin riveistä ja kaikkien havaittujen mutaatioiden sarakkeista. Aina yhdessä esiintyvät mutaatiot aiheuttivat matriisiin singulaarisuuden. Näin ollen kaikki näihin mutaatioihin liittyvät sarakkeet yhtä lukuun ottamatta jätettiin pois. Painovektoreiden ratkaisemiseen käytettiin pienimmän neliösumman menetelmää.
Kunkin kannan osalta poimittiin mutaatiot, joilla oli merkittävät positiiviset tai negatiiviset painot. Uusi mutanttikirjasto luotiin yhdistelemällä eri positioiden mutaatioita. Näin ollen mutaatiot ryhmiteltiin samanlaisen vaikutuksen perusteella. Ryhmissä voi olla yhteisiä mutaatioita, jotka vaikuttavat useisiin positioihin samanaikaisesti.
Tn5/DNA:n sitoutumisen stabiilisuuskoe
Standardin Tn5:n osoitettiin pysyvän sitoutuneena kohde-DNA:han merkitsemisen jälkeen (julkaisemattomat tulokset). Näin ollen merkityn DNA:n aukkotäyttö polymeraasilla ja DNA:n edelleen monistaminen PCR:llä estyy steerisen esteen vuoksi. Tn5 kuitenkin dissosioituu merkitystä DNA:sta, kun lämpötilaa nostetaan, jolloin polymeraasi voi edelleen täyttää aukkoja ja PCR:ää DNA:sta. Lämpötilaa, joka vaaditaan polymeraasin PCR-reaktion sallimiseksi, voidaan näin ollen käyttää eri Tn5-mutanttien Tn5/DNA:n sitoutumisstabiliteetin vertailuun. Mitä korkeampi lämpötila vaaditaan, sitä stabiilimpi kompleksi on.
Mutantti Tn5-059:ää tai vakio-Tn5:tä käytettiin B. cereus gDNA:n merkitsemiseen 1 ml:n reaktiossa Nexteran vakioprotokollan mukaisesti, paitsi että TD-puskuri korvattiin puskurilla, jossa oli 20 mM trisasetaattia pH 7,5, 5 mM magnesiumasetaattia. TD-puskuri sisältää magnesiumia, joten tämän ei pitäisi aiheuttaa ylimääräistä yhteisvaikutusta mutaatioiden kanssa, jotta insertion bias muuttuisi. 25 μL:n reaktioannokset annosteltiin PCR-levylle kolminkertaisesti ja inkuboitiin 55 °C:ssa 5 minuutin ajan, minkä jälkeen niitä sentrifugoitiin (1000 g 5 minuutin ajan 4 °C:ssa).
PCR:n sisältävää toista vaihetta varten valmistettiin PCR-sekoitus yhdistämällä 200 μL PPC:tä (PCR Primer -cocktail), 200 μL:aa i501:tä, 200 μL:aa i501:ää, 200 μL:aa i507:ää ja 400 μL:aa NPM:ää (reagensseja, joita toimitetaan vakiomuotoisessa Nextera-DNA:n DNA:n kirjastojen valmistelusekoituksessa). Tämän jälkeen 25 μL tätä seosta lisättiin kuhunkin PCR-levyllä olevaan 25 μL:n tagmentaatioreaktion aliquottiin, sekoitettiin pipetillä ja palautettiin termosykleriin. Lämpötilagradientti 72 °C:n ja 95 °C:n välillä luotiin levyn 12 pylvään yli ja sitä pidettiin 1 minuutin ajan, minkä jälkeen levyä inkuboitiin 72 °C:ssa 5 minuutin ajan ja sen jälkeen 98 °C:ssa 30 sekunnin ajan. Tämän aukkotäytteistys-denaturaatiovaiheen jälkeen suoritettiin Nextera DNA-kirjastojen valmistusmenetelmässä määritellyt 5 PCR-sykliä. Sen jälkeen levy sentrifugoitiin 1000 g:n nopeudella 5 minuutin ajan 4 °C:ssa. Kukin tagmentointi-PCR-vahvistettu reaktio puhdistettiin sen jälkeen Zymo Clean and Concentrator 96-kuoppalevyllä ja eluoitiin 25 μl:lla 10 mM Tris, pH 8,0. Kolminkertainen negatiivinen kontrollinäyte valmistettiin standardimerkintäprotokollan mukaisesti, mukaan lukien Zymo-puhdistus Tn5-transpoaasin poistamiseksi, mutta ilman PCR-vaihetta. Positiivisen kontrollin kolmoisnäyte valmistettiin standardimerkintäprotokollan mukaisesti, mukaan lukien Zymo-puhdistus Tn5-transposaasin poistamiseksi ja PCR-vaihe merkityn DNA:n monistamiseksi. Kaikki puhdistetut DNA-tuotteet laimennettiin sitten 1:10 10 mM Tris, pH 8,0:ssa ja kvantifioitiin käyttäen Picogreeniä ja lambda-DNA-standardia.
Tulokset osoittivat, että standardi Tn5 irtoaa merkitystä DNA:sta ja sallii siten myöhemmät aukkojen täyttö- ja PCR-reaktiot 74,2 °C:n lämpötilassa, kun taas Tn5-059 irtoaa 76,6 °C:n lämpötilassa (Lisätiedosto 3: Kuva S2). Tn5-059:n vaatima korkeampi lämpötila viittaa vakaampaan DNA:ta sitovaan kompleksiin.