Rekombinanttiproteiinien liukoisuuden parantaminen MBP-tagin avulla

E. coli-ekspressio

Rekombinanttiproteiinin tuottaminen edellyttää ekspressioisännän käyttöä, ja E. coli on yleensä paras valinta tähän tarkoitukseen. Yksinkertainen genetiikka, helppo viljeltävyys, nopea ilmentyminen ja korkea saanto tekevät siitä houkuttelevan isännän, kun taas tehokkaan translaation jälkeisen koneiston puute, koodonikäytön vääristymät ja vaikeus tuottaa suuremman molekyylipainon proteiineja tekevät siitä epäedullisen. Yksi E.coli-ekspression suurimmista ongelmista on kuitenkin liukenematon ekspressio – ilmiö, jossa rekombinanttinen yliekspressio johtaa liukenemattomien proteiiniaggregaattien, niin sanottujen inkluusiokappaleiden, muodostumiseen.

Tapoja käsitellä inkluusiokappaleita ja parantaa kohdeproteiinin liukoisuutta

Kun inkluusiokappaleita muodostuu, tutkijat kokeilevat yleensä hankalaa prosessia, jota kutsutaan in vitro -proteiinien liukenemiseksi ja uudelleen taittamiseksi, saadakseen liukoisen proteiinin talteen, tai he yrittävät optimoida ekspressiota prosessi- tai molekyylitasolla estääkseen insolubiliteettiongelmat.[

Esimerkkeinä prosessitasolla tapahtuvasta optimoinnista voidaan mainita menetelmät, jotka eivät edellytä kohdeproteiinien suunnittelua. Esimerkiksi ekspressio-olosuhteiden optimointi, kasvu- ja induktio-olosuhteiden säätäminen, väliaineiden ja puskurien muuttaminen jne. Vaihtoehtona olisi kokeilla molekulaarista lähestymistapaa ja manipuloida kohdeproteiinia poistamalla ei-toivottuja elementtejä sen sekvenssistä luomalla typistyksiä tai muuntamalla tiettyjä aminohappoja, jotta proteiinista tulisi liukoisempi. Voisit myös käyttää rationaalista, kohdekohtaista mutageneesimenetelmää, joka perustuu rakennetietoihin, tai käyttää suunnattua evoluutiota ja seuloa satunnaisten pistemutaatioiden, deletointien ja fragmenttien liukoisuutta. Parempi ja helpompi lähestymistapa olisi ottaa käyttöön fuusiokumppanistrategia ja käyttää ylempänä olevaa fuusiokumppania, joka tekisi kohdeproteiinista liukoisemman.

Fuusiokumppanilähestymistapa proteiinien liukoisuuden parantamiseksi

Tässä lähestymistavassa vaikeasti ekspressoitava proteiini tai peptidi fuusioidaan toiseen stabiiliin, hyvin liukoisessa tilassa olevaan proteiiniin ilmentymisen vakiinnuttamiseksi sillä ajatuksella, että fuusioproteiini ohjaa tuloksena syntyvää ilmentymistä. Vaikka monet proteiinit ovat hyvin liukoisia, ne eivät kaikki ole tehokkaita proteiinien liukoisuuden parantajia. Tässä suhteessa maltoosia sitova proteiini voi olla erittäin hyödyllinen proteiinin liukenemiskumppani. Vertailevassa tutkimuksessa, jonka tarkoituksena oli tutkia niiden proteiinien liukoisuutta parantavia ominaisuuksia, E. coli MBP-tunniste osoittautui paljon tehokkaammaksi proteiinien liukoisuutta parantavaksi kumppaniksi kuin glutationi-S-transferaasi (GST) ja tioredoksiini (TRx) -proteiinit.

Kuva 1: GenScriptin tutkijoiden suositus konstruktiosuunnittelusta

Tietoa MBP-tagista ja sen vaikutusmekanismista

MBP on noin 42 kDa:n kokoinen, E. coli -bakteerissa luonnostaan esiintyvä valkuaisaine, jota koodataan malE-geenillä ja joka vastaa hiilihydraatista maltodekstriinin (maltodekstriinin) sisäänotosta, pilkkomisesta ja kuljetuksesta. Se kehitettiin alun perin proteiiniekspressiomerkinnäksi 1980-luvulla, ja sen tiedetään parantavan merkittävästi erilaisten myöhemmässä vaiheessa fuusioitujen kohdeproteiinien liukoisuutta. Vaikka MBP-tunnisteen proteiinien liukoisuutta parantava tarkka mekanismi on epäselvä, sen tiedetään stabiloivan ja suojaavan myöhemmän ketjun matkustajaproteiinia proteolyyttiseltä hajoamiselta proteiinisynteesin aikana ja sen jälkeen. MBP-fuusioitujen proteiinien sytoplasminen saanto on yleensä myös suurempi, koska fuusioproteiini tarjoaa luotettavan kontekstin tehokkaalle translaation käynnistymiselle. On myös ehdotettu, että MBP-tunniste saattaisi toimia chaperonina vuorovaikutusten kautta sen pinnalla olevan liuottimelle altistuvan kuuman pisteen kautta, joka stabiloi muuten liukenemattoman matkustajaproteiinin.

MBP-tunnisteen käyttö

Vaikka MBP-tunnisteen, joka on fuusioitu joko N- tai C-terminaaliin, on osoitettu lisäävän rekombinanttiaineessa liukenevaa ilmentymistä, yleinen lähestymistapa on fuusioida se N-terminaaliin. Koska mikään tunniste ei valitettavasti voi olla ihanteellinen kaikkiin sovelluksiin, tunnisteiden ja jatkokäyttösovellusten monipuolisuuden lisäämiseksi on kehitetty kombinatorisia tunnistusmenetelmiä eri tarpeisiin. Kaksi affiniteettitunnistetta, jotka on ilmaistu rinnakkain yhdessä kohdeproteiinia edeltävän proteaasin pilkkomiskohdan kanssa, mahdollistaa useiden eri puhdistusstrategioiden käytön. Sisällyttämällä liukoisuutta parantava tagi yhdessä puhdistus-tagin kanssa saavutetaan parannuksia proteiinien liukoisuuteen ja ilmentymistulokseen sekä tehokkaita puhdistusmenetelmiä

Kuva 2: Yleinen kaaviokuva konstruktiosuunnittelustrategiasta – affiniteetti-/liukoisuustunnisteen yhdistelmä N-terminaalissa, proteolyyttinen pilkkomiskohta, jota seuraa kohdeproteiini, voi johtaa hyviin tuloksiin erityisesti liukenemattomille kohdeproteiineille. Linkkerisekvenssi voi usein auttaa proteolyyttisen pilkkoutumisen ongelmissa.

MBP-merkittyjen proteiinien puhdistaminen

Proteiinien liukoisuuden parantamisen lisäksi toinen MBP-fuusiostrategian käyttämisen etu on helpottaa myöhemmän kohdeproteiinin puhdistamista. MBP on luonnollinen affiniteettimerkki, joka sitoutuu amyloosihartsiin, ja sitä voidaan hyödyntää yksivaiheisessa affiniteettipuhdistuksessa sitoutumalla ristisilloitettuun amyloosiin. MBP-tagilla fuusioidut rekombinanttiproteiinit, jotka ovat sitoutuneet immobilisoituun amyloosiin, eluoidaan tyypillisesti ei-denaturoivissa olosuhteissa käyttäen maltoosia.

Tämän strategian haitat

• Kohdeproteiinin pilkkoutuminen voi olla ongelma MBP-tagin aiheuttaman steerisen esteen vuoksi
• Amyloosihartsi voi olla hauras ja suhteellisen kallis
• Kohdeproteiinin saostuminen pilkkoutumisen jälkeen
• Jotkut MBP-fuusioproteiinit eivät sitoudu tehokkaasti amyloosihartsiin, ja vaikka sitoutuisivatkin, saanto voi olla ongelma

Johtopäätökset

Kun ei olekaan olemassa yksinkertaista, yleistä ratkaisua liukenemattomuusongelmiin E.coli-ekspressioon, hyvin suunnitellulla konstruktiolla ja huolellisesti laaditulla ekspressiostrategialla voidaan saada aikaan haluttu liukoinen proteiini. MBP on luotettava liukoisuusmerkki rekombinanttien liukoisten proteiinien tuotannossa, ja vaikka liukoisuus on yksi proteiinien tuotantokampanjan tärkeimmistä elementeistä, lopputavoitteena ei aina pitäisi olla liukoisuus. Ekspressiotasot, proteiinin aktiivisuus, puhtaus, homogeenisuus ja stabiilisuus ovat kaikki tärkeitä tekijöitä, jotka on myös otettava huomioon ennen rekombinanttiproteiinin tuotantokampanjan aloittamista.

Vähän julkaisuja, jotka osoittavat MBP-tagin käyttökelpoisuuden

Fusokiinien tuottaminen käyttäen MBP -Maltoosia-Binding Protein Fusion Allows for High Level Bacterial Expression and Purification of Bioactive Mammalian Cytokine Derivatives (September 2014)

The rescue of aggregation-prone proteins using MBP -Rescuing aggregation-prone proteins in Escherichia coli with a dual His₆-MBP tag (May 2014)

MBP for soluble protein production in E. coli -Heksahistidiini-merkitty maltoosia sitova proteiini fuusiokumppanina liukoisten rekombinanttiproteiinien tuottamiseen Escherichia coli -bakteerissa (2009)

1. Pryor, K. A., ja Leiting, B. (1997). Liukoisen proteiinin korkean tason ilmentäminen Escherichia coli -bakteerissa käyttäen His6-tagin ja maltoosia sitovan proteiinin kaksoisaffiniteettifuusiojärjestelmää. Protein Expr. Purif. 10, 309-319
2. Routzahn, K. M. ja Waugh, D. S. (2002). Täydentävien affiniteettimerkkien erilaiset vaikutukset MBP-fuusioproteiinien liukoisuuteen. J. Struct. Funct. Genomics 2, 83-92
3. Nallamsetty, S., Austin, B. P., Penrose, K., J. ja Waugh, D. S. (2005) Gateway-vektorit yhdistelmämerkittyjen His6-MBP-fuusioproteiinien tuotantoon Escherichia colin sytoplasmassa ja periplasmassa. Protein Sci. 14, 2964-2971
4. Esposito D, Chatterjee DK: Liukoisten proteiinien ilmentymisen tehostaminen fuusiotunnisteiden avulla. Curr Opin Biotechnol 2006, 17:353-8.184.
5. Peti W, Page R: Strategies to maximize heterologous protein expression in Escherichia coli with minimal cost. Protein Expr Purif 2007, 51:1-10.]
6. Wilkes D.M., Ihmisen monilääkeresistenssigeenituotteen ensimmäisen nukleotidia sitovan domeenin ja linkkialueen ilmentäminen ja puhdistaminen: glutationi-S-transferaasin, tioredoksiinin ja maltoosia sitovan proteiinin fuusioiden vertailu. Biochemical Journal 1999, 77-81
7. Fox JD, Kapust RB, Waugh DS: Single amino acid substitutions on the surface of Escherichia coli maltose-binding protein can have a profound impact on the solubility of fusion proteins. Protein Sci 2001, 10:622-630

Suunnitteletko Bacterial Expression -projektia? Saat muutamassa sekunnissa ilmaisen tarjouksen BacPower™-takuunalaisista proteiiniekspressiopaketeistamme.

Tarjoukset ja tilaaminen

#Automaattinen tarjous luodaan vain, jos sekvenssit täyttävät takuupalvelun edellytykset, kuten oma sekvenssianalyysialustamme on määritellyt, ja jos näin ei tapahdu, tekninen asiakkuuspäällikkömme ottaa yhteyttä sinuun räätälöidyn proteiinien tuotantotarjouksen saamiseksi. Voit olla varma, että räätälöidyt palvelumme ovat yhtä laadukkaita ja kilpailukykyisiä kuin takuupalvelumme.

Asiakaspalvelijamme ovat käytettävissä 24 tuntia vuorokaudessa, maanantaista perjantaihin, auttaakseen sinua.