Solu- ja molekyylireaktiot akuuttiin kokaiinihoitoon hermosolujen kaltaisissa N2a-soluissa: Mahdollinen mekanismi sen vastustuskyvylle solukuolemassa

Materiaalit

Soluviljely

N2a-soluja (CCL-131, ATCC) ylläpidettiin yksikerrosviljelmänä48 , ja niitä on käytetty laajalti väärinkäytettäviä aineita14,49,50 tai keskushermoston sairauksia, kuten Parkinsonin tautia51 tai Alzheimerin tautia, koskevissa tutkimuksissa14,49,50 tai tutkimuksissa47,52,53. Yksi tämän solulinjan eduista on se, että kemiallisesta altistuksesta johtuvat hienot morfologiset muutokset voidaan helposti havaita solujen suuremman koon vuoksi. Ellei toisin mainita, kaikki tutkimuksemme kokeet tehtiin fenolipunattomassa RPMI-1640-mediassa, joka sisälsi 10 % FBS:ää. Viljelylevyille tai -maljoille kylvettyjen solujen annettiin kasvaa 4-5 päivää inkubaattorissa neuriittien spontaania erilaistumista varten. Kaikki tutkimukset toistettiin vähintään kaksi kertaa.

Morfologia

Solujen karkeaa morfologista arviointia varten kristalliviolettivärjätyt solut37 valokuvattiin EVOS Cell Imaging Systems -järjestelmällä ×40-objektiivilla. Joissakin tutkimuksissa kristalliviolettivärjättyjen solujen morfologiaa tai vakuoleja kuvattiin käänteisellä vaihekontrastimikroskoopilla IX-70 Olympus. Neuriittiulokkeet kvantifioitiin käyttämällä Image J -ohjelmistoa (National Institutes of Health).

Elektrofysiologia

Koko solun patch clampia käytettiin tallentamaan N2a-soluista, joita viljeltiin muovisilla peitelevyillä. Peitinliuskat pestiin kolme kertaa solunulkoisella tallennusliuoksella, joka sisälsi (mM:nä) 145 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 10 glukoosia ja 10 HEPES (312 mOsm, pH 7,4), ja niitä inkuboitiin tässä liuoksessa huoneenlämmössä. Peitelevyt jätettiin joko käsittelemättä tai käsiteltiin 6,25 μM tai 4 mM kokaiinilla suoraan solunulkoisessa liuoksessa tallennuksen aikana. Lasielektrodit (resistanssi 1-5 MΩ) täytettiin solunsisäisellä liuoksella, joka sisälsi (mM) 130 KCl, 2 NaCl, 10 HEPES ja 5 EGTA (292 mOsm, pH 7,4). Solut visualisoitiin faasikontrastissa Nikon Eclipse Ti-U käänteismikroskoopilla ja siihen liitetyllä DS-Qi1-monokromidigitaalikameralla.

Tallenteet tehtiin Axopatch 200B -vahvistimella (Molecular Devices, CA) ja digitoitiin Digidata 1440A -järjestelmällä (Molecular Devices, CA). Ionivirrat rekisteröitiin jännitepuristinprotokollalla (-60-135 mV 15 mV:n askelin, 250 ms kesto). Spontaanit postsynaptiset virrat tallennettiin jatkuvalla jännitepuristimella -80 mV: ssä 2 minuutin ajan. Virtapuristinprotokollaa (-100-200 pA 20 pA:n askelin, kesto 800 ms) käytettiin arvioimaan N2a-solujen kykyä laukaista toimintapotentiaalit vasteena virtainjektioon. Signaalit suodatettiin 1 kHz:n taajuudella ja näytteet otettiin 10 kHz:n taajuudella. Tiedot kerättiin ja analysoitiin pCLAMP 10 -ohjelmistolla (Molecular Devices, CA).

Käsittelyt

Tunnettu määrä kokaiinihydrokloridia liuotettiin fosfaattipuskuroituun keittosuolaliuokseen (PBS) 1 M:n varastona juuri ennen määrityksiä. Kokaiinin in vivo -farmakologisten pitoisuuksien simuloimiseksi, jotka vaihtelivat 1 nM:stä 6,25 μM:iin, valmistettiin useita työstövarastoja (0,04, 0,2, 0,4, 1, 2, 4, 8, 20, 40, 200 ja 400 μM) PBS:ään; vastaavasti korkeampia kokaiinipitoisuuksia (2, 3 ja 4 mM lopulliset pitoisuudet) varten valmistettiin työstövarastot, jotka olivat suuruusluokaltaan 80, 120 ja 160 mM, PBS:ään. Kustakin työvarastosta lisättiin 5 μl kokaiinia kuoppaa kohti, jotta saavutettiin halutut pitoisuudet ja estettiin pH:n muutokset elatusaineessa37. Lopullinen tilavuus kussakin kuopassa oli 200 μl. Alempien pitoisuuksien valinta perustui raportteihin, joissa kokaiinin nano- tai mikromolaarista alempiin molaareihin pitoisuuksiin narkomaanien keskushermostosoluissa13 , kun taas korkeammat pitoisuudet perustuivat useisiin in vitro -tutkimuksiin14,15,16. Kontrollina käytettiin soluja, joissa oli pelkkää elatusainetta tai yhtä suuri määrä elatusainetta (PBS) elatusaineessa, ja nollakokeena käytettiin elatusainetta, jossa ei ollut soluja. Aiempien C6-astroglian kaltaisilla soluilla6 tekemiemme tutkimusten perusteella myös tässä tutkimuksessa kokaiinikäsittelyt tehtiin vertailun vuoksi 1 tunnin ajan. Muuten kokaiinin vaikutus narkomaaneilla häviää tässä ajassa tyypillisillä saantimäärillä ja -reiteillä33. Osassa kokeista 96-kuoppalevyjen soluja esikäsiteltiin 1 µM YM155:llä, joka on survivinigeenin estäjä, 30 minuutin ajan, minkä jälkeen kokaiinia (2-4 mM) käytettiin yhdessä 1 tunnin ajan ja arvioitiin solujen elinkelpoisuutta, kun taas toisissa tutkimuksissa soluja esikäsiteltiin 5 μM:llä PIK-75:llä, joka on Nrf-224:n estäjä, 30 minuutin ajan ennen kokaiinin (2-4 mM) samanaikaista käsittelyä (1-24 mM), minkä jälkeen arvioitiin solujen elinkelpoisuutta ja GSH:n määrää.

Viabiliteetti ja vacuolaatio

Solujen elinkelpoisuus arvioitiin kristalliviolettivärin ottamisen avulla aiemmin kuvatulla tavalla54,55. Solujen vakuolaation laajuus kvantifioitiin glutaraldehydillä fiksoiduista soluista neutraalipunaväriaineen ottamisella aiemmin kuvatulla tavalla56. Väriaine uutettiin 70-prosenttisella etanolilla ja 0,37-prosenttisella suolahapolla, ja absorbanssi 540 nm:ssä mitattiin levylukulaitteella. Kristalliviolettivärjättyjä soluja käytettiin vakuolien fotomikrografiakuvaukseen käyttäen käänteistä vaihekontrastimikroskooppia IX-70 Olympus -mikroskooppia, jossa oli ×40-objektiivi.

Videomikroskooppi

Live-videokuvausta varten käänteisen vaihekontrastimikroskoopin IX-70 Olympus -mikroskoopin toinen okulaarilinsseistä korvattiin tavallisella okulaarisella videokamerajärjestelmällä. Videoliittimen ulostulo liitettiin tietokoneeseen kuvan visualisointia varten monitorilla käyttäen Electronic Ocular -R-AMCap -ohjelmistoa, jonka toimitti Zhejiang JinCheng Scientific & Technology Co., Ltd, (HangZhou, Kiina). Videodokumentaatio otettiin nopeudella 14 kuvaa sekunnissa.

Solukalvojen eheyden määritys

Solukalvojen eheys määritettiin mittaamalla sytoplasman LDH:n vapautuminen CytoTox 96 ei-radioaktiivisella määrityssarjalla (Promega, Madison, WI) valmistajan antamien ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti sanottuna 96-kuoppaisissa mikrotiterilevyissä olevia soluja käsiteltiin eri kokaiinipitoisuuksilla (2, 3 ja 4 mM) 1 tunnin ajan. Tämän jälkeen 50 μl testialustaa siirrettiin uuteen 96-kuoppalevyyn, sekoitettiin yhtä suureen tilavuuteen kitistä saatavaa substraattiseosta ja inkuboitiin 30 minuuttia 37 °C:ssa. Absorbanssi mitattiin levylukijassa 490 nm:ssä.

Solunsisäisen ROS:n mittaaminen

96-kuoppalevyjen soluja käsiteltiin kokaiinilla 2, 3 ja 4 mM:n pitoisuuksina 1 tunnin ajan, minkä jälkeen soluja värjättiin solun läpäisevällä väriaineella H2DCFDA:lla (10 μM lopullinen määrä) 30 minuutin ajan6. Solujen varovaisen pesun ja ilmakuivauksen jälkeen lisättiin PBS (100 μl/kuoppa). Levyt luettiin eksitaatiosuodattimen ollessa asetettu 485 nm:iin ja emissiosuodattimen 530 nm:iin automaattisessa lukulaitteessa (BioTek™ Synergy HTX multimode micro plate reader, BioTek Instruments, Winooski, VT).

Lipidiperoksidaatiomääritys

Solut kylvettiin lähtötiheydellä 0,3 × 106 solua kuoppaa kohden kuudelta kuopalta. Lipidiperoksidaatio mitattiin aiemmin kuvatulla tavalla57. Lyhyesti sanottuna sen jälkeen, kun soluja oli käsitelty kokaiinilla 2, 3 ja 4 mM 1 tunnin ajan, solut kerättiin talteen ja sentrifugoitiin 13 000 rpm:n kierrosnopeudella pöytämikrosentrifugissa 6 minuutin ajan. Kaikki solupelletit sonikoitiin PBS:ssä jäällä 3 s ajan ja siirrettiin lasiputkiin. Sitten lysaatit sekoitettiin 30 %:n trikloorietikkahappoon ja 0,37 %:n tiobarbituurihappoon (TBA). Seosta keitettiin 10 minuuttia, jäähdytettiin huoneenlämpötilaan (RT), siirrettiin uusiin falcon-putkiin ja sentrifugoitiin 3038 × g:ssa 10 minuuttia. Kirkas supernatantti siirrettiin 96-kuoppalevyyn ja absorbanssi 535 nm:ssä mitattiin mikrolevylukijalla. Kirkasta mediumia, jossa ei ollut soluja, käytettiin nollakokeena.

Yleinen mitokondrioiden metabolinen aktiivisuus ja kalvopotentiaali

Soluja (2 × 104) käsiteltiin eri pitoisuuksilla kokaiinia (2, 3 ja 4 mM) 1 tunnin ajan 96-kuoppaisissa mikrotiterilevyissä. Sitten levyt sentrifugoitiin 304 × g:n nopeudella 4 minuutin ajan, ja kokaiinia sisältävä väliaine hävitettiin huolellisesti. Kun soluihin oli välittömästi lisätty tuoretta elatusainetta (200 μl), lisättiin kuoppaa kohti 10 μl MTS:ää (3-(4,5-dimetyylitatsoli-2-yyli)-5(3-karboksimetonyylifenoli)-2-(4-sulfofenyyli)-2H-tetratsolium, Promega), kuten aiemmin on raportoitu58 , ja inkuboitiin 30 minuutin ajan 37 °C:ssa. Absorbanssi mitattiin mikrolevylukijalla 490 nm:ssä. Kalvopotentiaali määritettiin aikaisemman menettelyn mukaisesti46. Kun 1 tunnin kokaiinikäsittely oli päättynyt, yksikerroksiset solut peitettiin 100 μl:lla 0,25-prosenttista vesipitoista glutaraldehydiä fiksaatiota varten, joka sisälsi Rh 123:a, jotta loppupitoisuudeksi saatiin 2,6 μM, 30 minuutiksi RT:ssä. Supernatantti hävitettiin, levyt pestiin vedellä ja kuivattiin ilmakuivana hupussa. Lopuksi lisättiin 100 μl 0,1 % Triton×100:aa PBS:ssä kuoppaa kohti ja inkuboitiin 37 °C:ssa 1 h. Levyt luettiin BioTek™ Synergy™ HTX -monitoimimikrolevylukulaitteella, jossa eksitaatiosuodatin oli asetettu 485 nm:ään ja emissiosuodatin 538 nm:ään.

Laktaatin havaitseminen

Tutkimukset, jotka tehtiin soluilla, joita kasvatettiin 10 % FBS:ää sisältävässä väliaineessa, antoivat korkeita tausta-arvoja, jotka johtuivat seerumin vuorovaikutuksesta joidenkin kitin komponenttien kanssa (Trinity Biotech, Jamestown, NY). Niinpä myöhemmissä tutkimuksissamme ennen käsittelyjä 10 % FBS:ää sisältävä väliaine korvattiin pelkistetyllä seerumilla (0,1 % FBS) 96-kuoppaisissa mikrotiterilevyissä (2 × 104 solua kuoppaa kohti). Kitin reagenssi liuotettiin kromogeeniseen liuokseen, joka koostui 5,3 mM vanilliinihaposta, 2,9 mM 4-aminoantipyriinistä ja noin 4 yksiköstä piparjuuriperoksidaasia. 1 tunnin kokaiinikäsittelyn päätyttyä kitin reagenssi lisättiin suoraan kuoppiin (20 μl / 200 μl) ja levyjä pidettiin inkubaattorissa 37 °C:ssa värin kehittymistä varten (5-10 min). Kontrolliksi otettiin käsittelemättömien solujen absorbanssi ja nollakokeeksi otettiin väliaine, jossa ei ollut soluja. Absorbanssi mitattiin 490 nm:ssä mikrolevylukijassa.

NMR-spektroskopia

Laktaatin vapautuminen soluista havaittiin protonien (1H+) NMR-spektroskopialla. Koska seerumin määrä ei häiritse tätä menetelmää, käytimme 10 % FBS:ää väliaineessa 96-kuoppaisissa mikrotiterilevyissä (2 × 104 solua/200 μl kuoppaa kohti). 1 tunnin kokaiinikäsittelyn päätyttyä kunkin käsittelyn kaikkien toistojen (n = 12) väliaine (0,15 ml kuoppaa kohti) yhdistettiin (1,8 ml) merkittyihin putkiin. Käsittelemättömien solujen elatusainetta käytettiin kontrollina. Koska käsitellyt näytteet sisälsivät 2-4 mM kokaiinia, lisäsimme kokaiinia (4 mM lopullinen) väliaineen nollakokeeseen. NMR-analyysit tehtiin Bruker Avance 800 -laitteella (\(\nu _0\) = 800,23 MHz), joka on varustettu TCI 800S6 H-C/N-D-05 Z -kryosondilla (suurin z-kentän gradientin voimakkuus on 48 G/cm). Yksiulotteisen (1D) NMR-spektrin saamiseksi otettiin 16 transienttia, jotka laskettiin yhteen 3 s:n viiveellä. Datapisteitä (32 000) käytettiin 7500 Hz:n spektrin leveyden saamiseksi. Spektrissä 4,75 ppm:n kohdalla sijaitseva hallitseva vesipiikki poistettiin käyttämällä WATERGATE W5 -pulssisekvenssiä20. 3000 Hz:n kaistanleveys vesipiikin kummallakin puolella annettiin spektri-ikkunaksi liuotinpiikkien havainnoimiseksi käyttämällä WATERGATE-pulssisarjojen viiveaikaa 333,3 μs. Näyteliuoksen sisältämän laktaatin kvantifiointia varten valmistettiin ulkoinen standardi, 3,3 mM:n vesiliuos DMSO,

H2S:n mittaaminen soluviljelymediassa

Solut kylvettiin 96-kuoppalevyihin lähtötiheydellä 2 × 104 kuoppaa kohti. Ennen kokaiinikäsittelyä soluihin lisättiin 1,64-prosenttista vesipitoista sinkkiasetaattia59,60 (lopullinen: 0,041 %) haihtuvan H2S-kaasun muuttamiseksi sinkkisulfidiksi kokaiinikäsittelyn aikana. Kun soluja oli käsitelty 1 tunnin ajan 2, 3 ja 4 mM kokaiinilla, kuoppiin lisättiin 17,453 mM N,N-dimetyyli-p-fenyleenidiamiinisulfaattia 7,2 M HCl:ssä (lopullinen: 2,55 mM) ja 26,18 mM FeCl3:a 1,2 M HCl:ssä (lopullinen: 3,83 mM), ja kuoppia vorteksoitiin varovasti. Väliaineen kuplat poistettiin lisäämällä 5 μl kylmää etanolia kaikkiin kuoppiin juuri ennen levyjen lukemista 670 nm:ssä mikrolevylukijassa.

ATP-bioluminesenssimääritys

96-kuoppaisissa mikrotiitterilevyissä olevia soluja käsiteltiin eri kokaiinipitoisuuksilla (2, 3 ja 4 mM) 1 tunnin ajan. Kokonais-ATP mitattiin bioluminesenssi-ATP:n somaattisten solujen määrityssarjalla (FLASC, Sigma-Aldrich) valmistajan toimittamien sarjan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti sanottuna käsittelyn lopussa lisättiin 75 μl Somatic Cell ATP:tä vapauttavaa liuosta kuoppaa kohti solujen lysoimiseksi. Tämän jälkeen 50 μl lysaattia siirrettiin uusiin valkoisiin, kirkaspohjaisiin 96-kuoppalevyihin, jotka sisälsivät jo 50 μl ATP-assay mix -entsyymiä vähennetyssä valossa. Luminesenssi mitattiin välittömästi BioTek™ Synergy™ HTX -monitoimimikrolevylukijalla.

RNA:n eristäminen ja cDNA-synteesi

Solut kylvettiin tiheydellä 2 × 106 halkaisijaltaan 100 mm:n viljelymaljoille. Käsittelyhetkellä solut saavuttivat noin 65-70 %:n konfluenssin. Kun soluja oli käsitelty 1 tunnin ajan 2-4 mM kokaiinilla, ne kerättiin raaputtamalla ja sentrifugoitiin 1125 × g:ssä 5 minuutin ajan. Kokonais-RNA eristettiin valmistajan (Qiagen Sciences, German town, MD) toimittaman protokollan mukaisesti RNeasy mini spin -pylväiden avulla. Pylvääseen tehtiin DNaasi I (Qiagen Sciences) -käsittely. Kokonais-RNA eluoitiin pylväästä 20 μl:lla RNaasivapaata vettä. Kvantifiointia varten jäällä oleva RNA laimennettiin RNaasivapaaseen veteen suhteessa 1:10. Kokonais-RNA:n määrä mitattiin Nanodrop ND-1000 -spektrofotometrillä (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). RNA:n suhde oli >1,95 260/280 nm:ssä, ja sitä käytettiin sen jälkeen cDNA-synteesiin. Yksi mikrogramma kokonais-RNA:ta käytettiin cDNA:n tuottamiseen iScript cDNA-synteesikitillä (Bio-Rad, Hercules, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Relatiivinen ilmentyminen kvantitatiivisella RT-PCR:llä

Nrf-2:n, survivinin (Birc5) ja GAPDH:n geeniekspressioanalyysi qPCR:llä suoritettiin lämpösyklereillä, joissa oli käytössä MyiQ-ilmaisulaite (Bio-Rad) ja joissa käytettiin iQ-syBR Green -supermixiä. Nrf-2-, survivin- ja GAPDH-tuotteet syntetisoitiin erillisillä PCR-reaktioilla, jotka suoritettiin 20 μl:n lopullisessa tilavuudessa, jossa oli 2 μl cDNA-näytettä ja 500 nM spesifisiä alukkeita. Pyöritysolosuhteet olivat seuraavat: Tämän jälkeen tehtiin 40 sykliä 95 °C:ssa 15 sekunnin ajan, 55 °C:ssa 30 sekunnin ajan ja 72 °C:ssa 30 sekunnin ajan, ja PCR:n jälkeinen sulakäyräanalyysi tehtiin 55-95 °C:ssa. Geeniekspressioiden suhteellinen kvantifiointi suoritettiin 2-△△CT-menetelmän61 mukaisesti käyttäen GAPDH:ta endogeenisena kontrollina. Analyyseissä käytetyt alukesekvenssit on esitetty taulukossa 1.

Kokonais-GSH-määritys

Käsiteltyään soluja 96-kuoppaisilla mikrotiterilevyillä 96-kuoppalevyjen täydellisessä elatusaineessa erilaisilla kokaiinipitoisuuksilla (2-4 mM) 1 tunnin ajan solut fiksoitiin 0,25-prosenttisella glutaraldehydillä 30 minuutin ajaksi, tämän jälkeen ne pestiin hellävaraisesti kolmeen otteeseen, ja ne kuivattiin kuivattamalla ilmassa. Solujen kokonais-GSH määritettiin aiemmin kuvatulla tavalla62. Absorbanssi mitattiin 412 nm:ssä mikrolevylukijassa.

Kokosolulysaattien valmistaminen

Entsyymimäärityksiä varten solut kylvettiin 2 × 106:n tiheydellä halkaisijaltaan 100 mm:n viljelymaljoille. Kun soluja oli käsitelty 1 tunnin ajan 2-4 mM kokaiinilla, ne kerättiin solukaapimilla. Kun solupelletit oli sentrifugoitu 1620 × g:llä 5 minuutin ajan, ne säilytettiin -70 °C:ssa myöhempään käyttöön asti. Määrityspäivänä pelletit suspendoitiin uudelleen 0,5 ml:aan PBS:ää ja sonikoitiin kahdesti jäällä 15 s. Sisältö siirrettiin eppendorf-putkiin ja mikrosentrifugoitiin 5000 rpm:ssä 5 minuutin ajan. Supernatantit siirrettiin uusiin putkiin ja käytettiin entsyymimäärityksiin. Proteiinipitoisuus kussakin lysaatissa määritettiin BCA-proteiinimäärityssarjalla (Pierce, Rockford, IL) valmistajan ohjeiden mukaisesti käyttäen naudan seerumin albumiinia standardiviitteenä.

Katalaasimääritys

Katalaasi määritettiin aiemman menetelmän63 mukaisesti. Reaktioseos (450 μl) kvartsikyvetissä sisälsi 50 μl solulysaattia (60 μg), 250 μl 50 mM fosfaattipuskuria (pH 7,0). Reaktio käynnistettiin lisäämällä 150 μl 30 mM H2O2:ta (10 mM lopullinen). Absorbanssin vähenemistä 240 nm:ssä seurattiin 2 minuutin ajan Genesys 10 S UV-Vis -spektrofotometrissä (Thermo Scientific, Vernon Hills, IL). Entsyymiaktiivisuus laskettiin käyttämällä ekstinktiokerrointa 0,00706 per mmol per mm ja entsyymiaktiivisuuden yksikkö ilmaistiin mmol H2O2:na, joka hajoaa minuutissa per mg proteiinia. Tämän jälkeen käsiteltyjen näytteiden entsyymiaktiivisuutta verrattiin kontrolliin (100 %).

GPx-määritys

Määritys tehtiin julkaistun menettelyn mukaisesti64. Reaktioseos (500 μl) sisälsi 1 mM GSH:ta, 0,15 mM NADPH:ta, 0,12 yksikköä glutationireduktaasia (GR), 0,1 mM natriumatsidia 0,1 M kaliumfosfaatissa (pH 7,0 ja 1 mM EDTA:ta). Reaktioseokseen lisättiin natriumatsidia endogeenisen katalaasiaktiivisuuden estämiseksi. Reaktioseosta inkuboitiin 60 μg näytettä 10 minuutin ajan ilman NADPH:ta, ja reaktio käynnistettiin lisäämällä NADPH:ta ja H2O2:ta 150 μM:n loppupitoisuudessa. NADPH:n kulutuksen nopeutta seurattiin 340 nm:ssä 3 minuutin ajan. Yksi GPx-aktiivisuusyksikkö määriteltiin entsyymin määräksi, joka tarvittiin kuluttamaan 1 μmol NADPH:ta/min kytketyssä määrityksessä, ja aktiivisuus ilmaistiin mg proteiinia kohti. Tämän jälkeen käsiteltyjen näytteiden entsyymiaktiivisuutta verrattiin kontrolliin (100 %).

Statistinen analyysi

Kokeelliset tulokset (n = kuoppien lukumäärä yhdistettynä vähintään kahdesta eri kokeesta) esitettiin keskiarvona ± SEM. Kaikki pylväsdiagrammit piirrettiin GraphPad Prism -ohjelmistolla, versio 3.00 (San Diego, CA). Tiedot analysoitiin merkitsevyyden kannalta yksisuuntaisella ANOVA:lla ja sitten niitä verrattiin käyttämällä Dunnettin tai Bonferronin moninkertaisen vertailun testejä. Testiarvoja P < 0.05 ja P < 0.01 pidettiin vastaavasti merkitsevinä ja erittäin merkitsevinä.