Suun kautta annetun Atractylodes macrocephala Koidz -vesiuutteen vaikutus makrofagien ja T-solujen tulehdusreaktioon hiirissä

Abstract

Atractylodes macrocephala Koidz (AM) -juurakkeen juurakko on erilaisten Qi booster -yhdisteiden reseptien ainesosa. Arvioimme hiiristä eristettyjen makrofagien ja T-solujen tulehdusreaktioita AM-vesiuutteen (AME) oraalisen annon jälkeen. Peritoneaaliset eksudaattisolut eristettiin tioglykolaatti-injektion saaneista hiiristä ja tutkittiin muutoksia scavenger-reseptoreissa. Peritoneaalimakrofageja stimuloitiin lipopolysakkaridilla (LPS). Seerumin sytokiinivasteet vatsakalvon sisäiseen LPS-injektioon arvioitiin myös. Pernasolut eristettiin ja niiden koostumus ja toiminnalliset vasteet mitattiin. Tunnettujen anti-inflammatoristen ainesosien, atraktylenolidi I:n ja atraktylenolidi III:n, pitoisuus AME:ssa oli 0,0338 mg/g uutetta ja 0,565 mg/g uutetta. AME lisäsi SRA(+)CD11b(+)-solujen määrää vasteena tioglykolaatille. AME-ryhmästä eristetyissä peritoneaalimakrofageissa ei havaittu muutoksia tulehdusmerkkiaineissa, kuten tuumorinekroositekijä- (TNF-) α:ssa, interleukiini- (IL-) 6:ssa, indusoituvassa typpioksidisyntaasissa ja syklooksygenaasi-2:ssa, mutta CD86:n ilmentyminen väheni. Mielenkiintoista on, että AME vähensi seerumin TNF-α- ja IL-6-pitoisuuksia vatsansisäisen LPS-injektion jälkeen. Adaptiivisen immuunijärjestelmän osalta AME lisäsi CD4(+) T-solupopulaatiota ja päähistokompatibiliteettikompleksin luokan II molekyylin ilmentymistä pernassa, ja AME-ryhmän viljellyissä pernasoluissa ilmeni IL-4:n lisääntynyttä tuotantoa ja samalla vähentynyttä interferoni-γ:n tuotantoa T-solujen aktivaation aikana. AME edisti vatsakalvon makrofagien uusiutumista tulehdusreaktion aikana, mutta sen anti-inflammatorinen vaikutus ei näyttänyt johtuvan makrofagien aktiivisuuden moduloinnista. AME muutti myös CD4-T-solujen immuunitilaa edistämällä Th2-vastetta.

1. Johdanto

Tulehdus on suojaava vaste haitallisten ärsykkeiden eliminoimiseksi, ja immuunisolut ovat tärkeimmät osallistujat tässä prosessissa. Riippuen antigeenin tunnistamisen tavasta ja kyvystä tuottaa muistivaste, immuunisolut jaetaan synnynnäiseen immuunijärjestelmään ja adaptiiviseen immuunijärjestelmään . Synnynnäiset immuunisolut, kuten makrofagit ja dendriittiset solut, reagoivat välittömästi antigeeniin rajallisella reseptorispesifisyydellä . Adaptiiviset immuunisolut, jotka koostuvat T- ja B-soluista, ovat antigeenispesifisiä, käynnistävät vasteen perifeeriseen imukudokseen joutuneelle antigeenille ja tuottavat muistivasteen . Synnynnäiset immuunisolut ovat tärkeimpiä toimijoita tulehduksen alkuvaiheessa, mutta ajan myötä adaptiiviset immuunisolut ottavat ohjat käsiinsä.

Kudoksessa asuvilla makrofageilla on keskeinen rooli immuniteetissa ja kudoksen eheydessä . Useimmat kudosmakrofagit ovat peräisin alkion esiasteista . Vakaassa tilassa niiden populaatioita ylläpidetään pitkäikäisyytensä ja paikallisen proliferaation avulla, ja osa makrofageista täydentyy veren monosyyttisoluista peräisin olevilla soluilla . Tulehduksen aikana luuytimestä peräisin olevat monosyytit rekrytoituvat paikalle ja erilaistuvat makrofageiksi . Makrofagit eliminoivat patogeenejä ja antigeenejä fagosytoosin avulla ja aiheuttavat tulehdusreaktioita tuottamalla sytokiineja ja entsyymejä, kuten tuumorinekroositekijä- (TNF-) α:ta, interleukiini- (IL-) 6:ta, indusoituvaa typpioksidisyntaasia (iNOS) ja syklooksygenaasi- (COX-) 2:ta.

T-solut, jotka koostuvat pääasiassa CD4-T-soluista ja CD8-T-soluista, aktivoituvat, kun T-solureseptorit (TCR) joutuvat kosketuksiin APC-solujen suurten histokompatibiliteettikompleksien (MHC) molekyylien sitomien antigeenipeptidien kanssa. CD4-T-solut, jotka muodostavat yli kaksi kolmasosaa T-soluista, voivat erilaistua erilaisiksi efektori-T-auttajasoluiksi (Th-soluiksi), kuten Th1-, Th2-, Th17-, T-follikulaarisiksi auttajasoluiksi ja T-säätelysoluiksi . Näistä alaryhmistä Th1- ja Th2-solut olivat ensimmäiset tyypit, jotka määriteltiin. Th1-solut erittävät runsaasti interferoni- (IFN-) γ:tä ja puolustautuvat tehokkaasti solunsisäisiä patogeenejä vastaan aktivoimalla makrofageja, kun taas Th2-solut erittävät interleukiini (IL-) 4:ää, IL-5:tä ja IL-13:aa ja suojaavat isäntää helmintti-infektiolta rekrytoimalla eosinofiilejä ja syöttösoluja . Vaikka nämä T-apusolut ovat tärkeitä isännän puolustuksen kannalta, minkä tahansa Th-solutyypin krooninen aktivoituminen voi aiheuttaa immuunivälitteisiä häiriöitä. Th1-soluilla on kriittinen rooli elinspesifisessä autoimmuniteetissa ja kroonisissa tulehdushäiriöissä, ja Th2-solut ovat vastuussa allergisesta tulehduksesta.

Compositae-heimoon kuuluvan Atractylodes macrocephala Koidzin (AM) juurakkoa on käytetty ruoansulatuskanavan toiminnallisten vikojen, kuten ruokahaluttomuuden, vatsan turvotuksen ja ripulin, hoitoon. Perinteisen kiinalaisen lääketieteen mukaan AM virkistää Qi:tä poistamalla epänormaalia nesteen kertymistä ruoansulatuskanavaan. AM on erilaisten Qi:tä vahvistavien yhdistelmäreseptien ainesosa. Perinteisessä kiinalaisessa lääketieteessä yksi Qi:n olennaisista tehtävistä on puolustautuminen. Tästä syystä Qi:tä vahvistavien yrttien ajatellaan vahvistavan immuunijärjestelmää. Koska Qi:tä vahvistavia yrttejä käytetään ennaltaehkäisevästi sellaisten henkilöiden immuunijärjestelmän tilan parantamiseksi, joilla ei ole ilmeisiä vikoja, on tarpeen arvioida, miten immuunijärjestelmä voi muuttua normaaleilla henkilöillä AM:n antamisen jälkeen. Vaikka AM:ää käytetään usein, sen vaikutuksia immuunijärjestelmään on tutkittu vain harvoissa tutkimuksissa.

AM sisältää useita bioaktiivisia seskviterpenoideja, kuten atraktylenolidi I:tä, atraktylenolidi II:ta ja atraktylenolidi III:ta sekä polyasetyleenejä . Makrofagien in vitro -käsittely atraktylenolidi I:llä, atraktylenolidi III:lla ja joillakin polyasetyleeniyhdisteillä esti lipopolysakkaridin (LPS) indusoimaa TNF-α- ja iNOS-ekspressiota . Näiden lipidiliukoisten komponenttien oraalinen anto osoitti tulehdusta ehkäisevää vaikutusta hiirillä . Suurin osa perinteisistä kasvirohdosvalmisteista on kuitenkin vesipohjaisia keittosekoituksia, mikä johtaa farmakologisesti aktiivisten lipidiliukoisten komponenttien vähäiseen saantoon. Lisäksi polyasetyleenit tuhoutuvat helposti kiehuvassa vedessä. Tämän vuoksi halusimme selvittää, esiintyykö hiiristä eristetyissä makrofageissa, joille on annettu kiehuvaan veteen uutettua AM-valmistetta (AME), anti-inflammatorisia vasteita. Tutkimme myös AME:n vaikutusta seerumin tulehdusvasteeseen. Lopuksi tutkimme pernasolujen koostumusta ja toiminnallista vastetta mahdollisten muutosten havaitsemiseksi adaptiivisessa immuunijärjestelmässä AME-lisäyksen jälkeen.

2. Materiaalit ja menetelmät

2.1. Materiaalit ja menetelmät. Näytteen valmistelu

Eusungista (Etelä-Korea) peräisin oleva AME ostettiin E-Pulip Co., Ltd.:ltä. (erä EPL1356-4) (Soul, Etelä-Korea). Voucher-näyte (# 2013-AM) talletettiin Kyung Heen yliopiston kasviperäisen immunologian laboratorioon. Lyhyesti sanottuna 100 g näytettä jauhettiin, uutettiin 1 l:lla deionisoitua vettä (DW) refluksilaitteessa ja lämmitysvaipassa 2 tunnin ajan 95 °C:ssa ja suodatettiin Whatmanin numero 2 -suodatinpaperin (Whatman International, Kent, Englanti) läpi. Uute väkevöitiin kiertohaihduttimella ja pakkaskuivattiin tyhjiössä. AME:n saanto oli 37,7 %. Korkean suorituskyvyn nestekromatografian (HPLC) analyysiä varten 0,4 g AME:ta liuotettiin 10 ml:aan DW:tä ja sonikoitiin 5 minuutin ajan 25 °C:ssa. Uutetta lisättiin etyyliasetaattiin, ravistettiin sekoittamiseksi ja annettiin seistä 1 minuutin ajan. Etyyliasetaatin ylempi kerros siirrettiin ja tämä menettely toistettiin kolme kertaa. Viimeinen etyyliasetaattikerros väkevöitiin ja pakkaskuivattiin.

2.2. HPLC

Näytteet analysoitiin käänteisfaasihPLC-järjestelmällä (Shimadzu 20A, Kioto, Japani), joka koostui automaattisesta näytteenottimesta (SIL-20A), binääripumpusta (LC-20AD) ja fotodiodiryhmäilmaisimesta (SPD-20A) ja joka oli varustettu YMC-Triart C18-kolonnilla (5 μm × 4,6 mm × 250 mm) (YMC, Kioto, Japani). Kahden liuottimen järjestelmän (liuotin A, 0,05 % fosforihappo vedessä; liuotin B, asetonitriili) gradienttivirrat olivat seuraavat: 85 % A/15 % B 0 minuutissa, 85 % A/15 % B 5 minuutissa, 50 % A/50 % B 15 minuutissa, 50 % A/50 % B 20 minuutissa, 40 % A/60 % B 25 minuutissa, 40 % A/60 % B 30 minuutissa, 15 % A/85 % 35 minuutissa, 15 % A/85 % 40 minuutissa, 85 % A/15 % 42 minuutissa ja 85 % A/15 % 45 minuutissa. Liikkuvan faasin virtausnopeus oli 1,0 ml/min ja injektiotilavuus 10 μl. Detektointi suoritettiin 220 nm:ssä atraktylenolidi III:n (Sigma, St. Louis, MO, USA) tai 280 nm:ssä atraktylenolidi I:n (Sigma) osalta.

2.3. Eläimet

Seitsemän viikon ikäiset urospuoliset Balb/c-hiiret hankittiin SamTacolta (Osan, Etelä-Korea) ja ne pidettiin lämpötila- ja kosteussäädellyssä patogeenivapaassa eläintilassa, jossa oli 12 tunnin valo-pimeä jakso. Kaikille eläimille tehtiin 1 viikon säätö ennen kokeita. Annokset määritettiin käyttämällä laskelmaa, joka ekstrapoloitiin hiiren ja ihmisen kehon pinta-alan eron perusteella. Suositeltu AM-annos 60 kg painavalle aikuiselle ihmiselle on 8-24 g raakakasvia päivässä tai 3-9 g uutetta päivässä (tässä tutkimuksessa saadun uuttotuotoksen perusteella). Hiiren annos voidaan määrittää seuraavasti: ihmisen vastaava annos 50-150 mg/kg × 12,3 (muuntokerroin) = hiiren annos 615-1 845 mg/kg. Tämän annosalueen perusteella valitsimme tähän tutkimukseen annokset 500 mg/kg ja 2 500 mg/kg. Eläimet jaettiin satunnaisesti koeryhmiin. AME annettiin suun kautta kerran päivässä 10 päivän ajan. Ryhmien välillä ei ollut eroja ruumiinpainossa koejakson aikana. Kyung Heen yliopiston laitoseläinten hoito- ja käyttökomitea hyväksyi eläinprotokollan (KHUASP(SE)-15-012), ja hiiristä huolehdittiin Yhdysvaltain kansallisen tutkimusneuvoston (US National Research Council for the Care and Use of Laboratory Animals, 1996) määritysten mukaisesti. Makrofagien valmistelu

Makrofagien eristämistä varten hiirille ruiskutettiin vatsansisäisesti 2 ml 3,5-prosenttista steriiliä tioglykolaattia (BD, Sparks, MD, USA) 4 päivää ennen uhrausta. Kokeen lopussa hiiret uhrattiin kohdunkaulan sijoiltaanmenolla ja vatsakalvon eksudaattisolut eristettiin aseptisesti vatsakalvon huuhtelulla kylmällä DMEM:llä (Hyclone, Logan, UT, USA), joka sisälsi 10 % naudan sikiöseerumia (FBS; Hyclone) ja 1 % penisilliiniä ja streptomysiiniä. Sentrifugoinnin jälkeen solut resuspendoitiin ja laskettiin TC20-solulaskurilla (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

2.5. Pernasolujen valmistelu

Pernasolujen eristämistä varten perna otettiin aseptisesti kokeen lopussa. Kun perna oli hajotettu lasilevyjen välissä RPMI 1640:ssä (Hyclone), jossa oli 1 % FBS ja 1 % penisilliini-streptomysiini, solut suodatettiin 70 μm:n solusiivilän läpi. Sentrifugoinnin jälkeen punasolut lysoitiin BD PharmLyse -lyysipuskurilla (BD Biosciences, San Diego, CA, USA). Solut resuspendoitiin RPMI 1640:ssä, jossa oli 10 % FBS:ää ja 1 % penisilliini-streptomysiiniä, ja ne laskettiin T20-solulaskurilla.

2.6. LPS:n intraperitoneaalinen injektio

Hiirille injisoitiin kokeen lopussa intraperitoneaalisesti 1,3 mg/kg LPS:ää (serotyyppi 055:B5, Sigma). 1 tunnin kuluttua hiiret nukutettiin eetterillä ja veri kerättiin sydänpunktiolla. Seerumi saatiin ja se säilytettiin -20 °C:ssa analyysiin asti.

2.7. Soluviljely

Peritoneaalisen eksudaatin solut sijoitettiin 6-kuoppalevyihin tai 60 mm:n astioihin ja inkuboitiin yön yli 37 °C:ssa. Tarttumattomien solujen poistamisen jälkeen kiinnittyneitä soluja stimuloitiin 100 ng/ml LPS:llä 24 h. Supernatantti ja solut kerättiin myöhempiä määrityksiä varten. Pernasolut sijoitettiin 24-kuoppalevyille ja stimuloitiin 2 μg/ml anti-CD3-vasta-aineella (BD Biosciences) 48 h. Supernatantti kerättiin sytokiinianalyysiä varten.

2.8. Virtaussytometria

Solut pestiin kahdesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja resuspendoitiin 1 × 106 solua/ml FACS-puskurissa (PBS/0,1 % NaN3/1 % FBS). Soluja blokattiin rotan anti-hiiren CD16/CD32-vasta-aineella (BD Biosciences) 4 °C:ssa 5 minuutin ajan, minkä jälkeen solut värjättiin fluoresceiinikonjugoidulla anti-hiiren SR-AI:lla, PE-konjugoidulla anti-hiiren LOX1:llä (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), PE-konjugoidulla anti-hiiren CD36, FITC-konjugoitu CD11b, PE-konjugoitu anti-CD11b, PE-konjugoitu antihiiri CD86, FITC-konjugoitu antihiiri CD4, PE-konjugoitu antihiiri CD8a, FITC-konjugoitu antihiiri CD19 ja FITC-konjugoitu antihiiri IA/IE (BD Biosciences) (kaikki vasta-aineet laimennettiin 1:100) 30 minuutin ajan jäällä pimeässä. Vastaavia isotyyppivasta-aineita käytettiin epäspesifisen sitoutumisen osoittamiseksi. Solut pestiin ja suspendoitiin uudelleen FACS-puskurissa. Navios-virtaussytometrillä (Beckman Coulter, La Brea, CA, USA) kerättiin yhteensä 10 000 tapahtumaa, ja tiedot käsiteltiin Kaluza-ohjelmistolla (Beckman Coulter).

2.9. Sytokiinianalyysi

TNF-α:n, IL-6:n, IFN-γ:n ja IL-4:n pitoisuudet supernatanteissa ja seerumeissa määritettiin BD OptEIA-hiiri-ELISA-sarjoilla (BD Biosciences) valmistajan protokollan mukaisesti.

2.10. Proliferaatiomääritys

Splenosyyttejä (4 × 105) 96-kuoppalevyissä stimuloitiin liukoisella anti-CD3 mAb:llä (2 μg/ml) 48 h. Solujen proliferaatio määritettiin CellTiter96 One Solution Cell Proliferation assay kitillä (Promega, Madison, WI, USA).

2.11. RNA:n eristäminen ja reaaliaikainen PCR

Totaalinen RNA eristettiin käyttäen FavorPrep Total RNA Purification Kit -sarjaa (Favorgen Biotech, Pingtung, Taiwan) ja cDNA käänteistranskriboitiin High Capacity RNA-to-cDNA kitillä (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Laimennettu cDNA sekoitettiin Power SYBR Green PCR Master mixin (Applied Biosystems) ja 2 pmol:n iNOS-, COX2- tai GAPDH-spesifisten alukkeiden kanssa. cDNA:n monistaminen suoritettiin StepOnePlus-reaaliaikaisella PCR-järjestelmällä (Applied Biosystems). Alustavan lämpödenaturaation jälkeen 95 °C:ssa 10 minuutin ajan PCR-olosuhteet asetettiin 95 °C:seen 15 sekunnin ajaksi ja 60 °C:seen 1 minuutin ajaksi 40 syklin ajaksi. Jokaiseen PCR:ään sisällytettiin negatiivisena kontrollina vastaava mRNA-näyte ilman käänteistä transkriptiota. KDNA:n kopiomäärän kvantifiointi suoritettiin käyttämällä standardikäyrää.

2.12. Tilastollinen analyysi

Tiedot esitettiin keskiarvon keskivirheenä (SEM). Ryhmien välisten erojen vertailemiseksi käytettiin kaksipuolista Studentin t-testiä tai kaksisuuntaista varianssianalyysiä. Jos tilastollinen analyysi osoitti, että useiden ryhmien väliset erot olivat merkitseviä, jatkovertailuun käytettiin Tukeyn post hoc -testiä. Kaikki tilastolliset analyysit tehtiin IBM SPSS 22.0 -ohjelmistolla (IBM, Chicago, IL, USA). P-arvoja, jotka olivat alle 0,05, pidettiin merkitsevinä.

3. Tulokset

3.1. Tulokset

3. Atraktylenolidi I:n ja atraktylenolidi III:n pitoisuudet AME:ssa

Tunnetuista laadunvalvontamerkkiaineista atraktylenolidi I ja atraktylenolidi III ovat todennettuja anti-inflammatorisia yhdisteitä in vitro . AME:n etyyliasetaattifraktio tunnistettiin alustavasti käyttämällä aitoja standardeja, joihin oli lisätty piikkejä, ja vertaamalla retentioaikoja ja UV-violettispektrin kuvioita. HPLC-kromatogrammit on esitetty kuvassa 1. Atraktilenolidi I:n pitoisuus AME:ssa oli 0,0338 mg/g uutetta ja atraktilenolidi III:n pitoisuus 0,565 mg/g uutetta.

(a)

(b)

(c)

(d)

.
(a)
(b)
(c)
(d)

Kuva 1

Atractylodes macrocephala -vesiuutteesta (AME) tehdyt HPLC-kromatogrammit. (a, b) Standardimarkkerit. (c, d) AME.

3.2. Vertailumerkit. AME:n oraalisen annon vaikutus scavenger-reseptorin ilmentymiseen hiiren peritoneaalieksudaattisoluissa

Tioglykolaatin intraperitoneaalista injektiota käytetään yleisesti steriilin vatsakalvotulehduksen indusoimiseksi ja peritoneaalisten makrofagien rikastamiseksi hiiristä laboratorioissa . Suurin osa vatsakalvon makrofageista on peräisin veren monosyyteistä . Keräsimme tällä menetelmällä vatsakalvon eksudaattisoluja AME-käsitellyistä hiiristä. Makrofagien merkkiaineena käytettiin CD11b:tä. SRA:n, CD36:n ja LOX-1:n kaltaiset scavenger-reseptorit säätäytyvät monosyyttien muuttuessa makrofageiksi ; siksi tutkimme näiden proteiinien ilmentymistä. SRA, CD36 ja LOX-1 ilmentyivät lähes yksinomaan CD11b(+)-soluissa (kuvat 2(a)-2(c)). SRA(+)CD11b(+)-solujen prosenttiosuus kontrolliryhmässä oli 66 %, ja hoito 500 mg/kg ja 2 500 mg/kg AME:lla lisäsi merkittävästi tätä populaatiota 69 %:iin ja 76 %:iin. CD36(+)CD11b(+)- ja LOX-1(+)CD11b(+)-solupopulaatioiden taajuudet kontrolliryhmässä olivat 95 % ja 14 %, ja AME ei aiheuttanut merkittäviä muutoksia kummassakaan populaatiossa. SRA(+)CD11b(+)-solupopulaation lisääntyminen osoittaa, että AME voi stimuloida veren monosyyttien erilaistumista makrofageiksi vastauksena tioglykolaattiin.

(a)

(b)

(c)

(d)

.
(a)
(b)
(c)
(d)

Kuva 2

Scavenger-reseptorit, joita ilmentyvät vatsakalvon eksudaattisoluissa oraalisen AME:n antamisen jälkeen. Hiirille annettiin suun kautta AME:ta (500 tai 2500 mg/kg) 10 päivän ajan. Peritoneaaliset eksudaattisolut eristettiin tioglykolaatti-injektion saaneista hiiristä ja kaksoisvärjättiin FITC-konjugoidulla anti-SRA- ja PE-konjugoidulla anti-CD11b-abs:llä (a), FITC-konjugoidulla anti-CD11b- ja PE-konjugoidulla anti-CD36-abs:llä (b) tai FITC-konjugoidulla anti-CD11b- ja PE-konjugoidulla anti-LOX-1-abs:llä (c). Solut analysoitiin virtaussytometrialla, ja edustavat pistekuviot on esitetty. (d) Palkit edustavat keskiarvoa ± SEM (n=6). P <0.05, P<0.005 verrattuna kontrolliin.

3.3. AME:n oraalisen annon vaikutus LPS-stimuloitujen makrofagien pinnan CD86-ekspressioon

Kostimuloivia molekyylejä, kuten makrofagien CD86:ta, tarvitaan vahvistamaan makrofagien ja Th-solujen välistä yhteistoimintaa . AME-käsitellyistä hiiristä eristettyjä peritoneaalisia makrofageja stimuloitiin LPS:llä 24 tunnin ajan ja CD86:n kalvoekspressio mitattiin virtaussytometrialla. LPS-stimulaatio lisäsi CD86:n keskimääräistä fluoresenssin intensiteettiä 5,24:stä 11,24:ään (kuva 3). CD86:n keskimääräinen fluoresenssin intensiteetti laski merkittävästi 500 ja 2 500 mg/kg:n ryhmissä 10,14:ään ja 10,59:ään. Nämä tulokset osoittavat, että AME voi vaikuttaa makrofagien ja Th-solujen väliseen vuorovaikutukseen.

(a)

(b)

(a)
(b)

Kuva 3

AME:n vaikutus costimulatoristen molekyylien pintaekspressioon LPS-stimuloiduissa makrofageissa. Kontrolli- ja AME-ryhmistä eristettyjä peritoneaalisia makrofageja stimuloitiin 100 ng/ml LPS:llä 24 tunnin ajan ja värjättiin sitten PE-konjugoidulla anti-CD86-vasta-aineella. (a) Esitetään edustavat histogrammit. (b) Palkit edustavat keskiarvoa ± SEM (n=6). (-): ilman LPS:ää, (+): LPS-hoito. MFI: keskimääräinen fluoresenssin intensiteetti. # P<0.005 verrattuna kontrolliin (-), P<0.05 verrattuna kontrolliin (+).

3.4. AME:n oraalisen annon vaikutukset tulehdussytokiinivasteeseen makrofageissa ja seerumissa

Kysyimme ensin, vaikuttaako AME:n oraalinen anto makrofagien tulehdusvasteeseen. Kontrolliryhmän tai suurten AME-annosten ryhmän peritoneaalisia makrofageja stimuloitiin LPS:llä 24 tunnin ajan ja TNF-α:n ja IL-6:n tuotanto supernatantissa mitattiin. TNF-α:n erityksessä ei ollut eroa kontrolli- ja AME-ryhmien välillä, mutta IL-6:n taso oli suurentunut AME-ryhmässä (kuva 4 a)). Havaitsimme myös, että AME ei aiheuttanut muutoksia iNOS- ja COX-2-geenien ilmentymisessä LPS:llä stimuloiduissa soluissa (kuva 4(b)). Seuraavaksi tutkimme AME-käsiteltyjen hiirten systeemistä vastetta vatsansisäiseen LPS-stimulaatioon. AME vähensi seerumin TNF-α- ja IL-6-pitoisuuksia 20 % ja 47 % (kuva 5). Nämä havainnot osoittavat, että AME:n anti-inflammatorinen vaikutus voi tapahtua makrofagien modulaatiosta riippumatta.

(a)

(b)

(a)
(b)

Kuva 4

AME:n vaikutus tulehdussytokiineihin ja entsyymeihin LPS-stimuloiduissa makrofageissa. Kontrolli- tai AME-ryhmästä (2500 mg/kg) eristettyjä makrofageja stimuloitiin LPS:llä (100 ng/ml) 24 h. (a) Tumorinekroositekijä- (TNF-) α:n ja interleukin- (IL-) 6:n pitoisuudet supernatantissa määritettiin ELISA:lla. (b) Kvantitatiivista PCR:ää käytettiin iNOS- ja COX-2-geenien ilmentymisen mittaamiseen. Kohdegeenien ilmentyminen normalisoitiin GAPDH:n ilmentymiseen. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM (n=6). (-): ilman LPS:ää, (+): LPS-hoito. AME (2500 mg/kg) annettiin hiirille suun kautta 10 päivän ajan. Seerumi otettiin 1 h LPS:n (1,3 mg/kg) vatsansisäisen injektion jälkeen ja seerumin TNF-α- ja IL-6-pitoisuudet määritettiin ELISA:lla. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM (n=10). (-): ilman LPS:ää, (+): LPS-hoito. # P<0.001 verrattuna kontrolliin (-), P <0.05, P <0.001 verrattuna kontrolliin (+).

3.5. AME:n oraalisen annostelun vaikutukset pernan T- ja B-solupopulaatioihin ja MHC II:n ilmentymiseen

Määrittääksemme, muuttaako AME:n oraalinen annostelu adaptiivisia immuunisoluja, analysoimme pernan CD4- ja CD8-T-solujen ja B-solujen prosentuaaliset osuudet kontrolli- ja AME-ryhmissä. CD4(+) T-solupopulaatio kasvoi merkittävästi 23,4 prosentista 27,2 prosenttiin ja 26,9 prosenttiin 500 ja 2500 mg/kg:n ryhmissä (kuvat 6(a) ja 6(d)). CD8-T-solu- ja B-solupopulaatioissa ei havaittu eroja (kuvat 6(a), 6(b) ja 6(d)). MHC-luokan II molekyylejä tarvitaan antigeenien esittämiseen CD4-T-soluille. Analysoimme hiiren MHC-luokan II molekyylien IA/IE ilmentymistä pernassa ja havaitsimme, että MHC II -molekyylien keskimääräinen fluoresenssin voimakkuus kasvoi merkittävästi 65,3:sta 68,9:ään 2 500 mg/kg AME-ryhmässä (kuvat 6(c) ja 6(e)). Nämä havainnot viittaavat siihen, että AME aiheuttaa muutoksia adaptiivisessa immuunijärjestelmässä.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)

Kuva 6

Oraalisen AME:n antamisen vaikutukset pernan adaptiivisen immuunijärjestelmän koostumukseen. Pernasolut eristettiin kontrolli- tai AME-ryhmistä ja kaksoisvärjättiin FITC-konjugoidulla anti-CD4-vasta-aineella ja PE-konjugoidulla anti-CD8-vasta-aineella (a), FITC-konjugoidulla anti-CD19-vasta-aineella (b) tai FITC-konjugoidulla anti-MHC II -vasta-ainevasta-aineella (c) ja arvioitiin virtaussytometrialla. (a-c) Esitetään edustavat pisteblotit tai histogrammit. (d-e) Pylväät edustavat keskiarvoja±SEM (n=6). P <0.001 verrattuna kontrolliin.

3.6. Suun kautta annetun AME:n vaikutukset T-solujen proliferaatioon ja Th1/Th2-sytokiinivasteeseen pernasoluissa

Tutkimme pernan T-solujen toimintaa AME-hoidon jälkeen. Kontrolli- tai AME-ryhmistä eristettyjä pernasoluja stimuloitiin anti-CD3-vasta-aineella, joka on mitogeeni, joka aktivoi koko T-solupopulaation antigeenireseptorispesifisyydestä riippumatta. Anti-CD3-vasta-aineen käsittely 48 tunnin ajan lisäsi optista tiheyttä 2,6-kertaiseksi MTS-määrityksellä mitattuna. Anti-CD3-vasta-aineen aiheuttamassa proliferaatiossa ei ollut eroa kontrolli- ja AME-ryhmien välillä (kuva 7 a)). IFN-γ ja IL-4 ovat edustavia sytokiineja Th1- ja Th2-soluille. Arvioimme IFN-γ:n ja IL-4:n eritystä anti-CD3-vasta-aineella stimuloiduissa pernasoluissa. IFN-γ:n erityksen havaittiin vähentyneen merkittävästi 500 mg/kg:n AME-ryhmässä, kun taas IL-4:n eritys lisääntyi merkittävästi 2500 mg/kg:n ryhmässä (kuva 7(b)). Vaikka annosriippuvuutta ei havaittu, AME:lla oli taipumus edistää Th2-vastetta.

(a)

(b)

(a)
(b)

Kuva 7

AME:n vaikutukset aktivoituneiden pernan T-solujen proliferaatioon ja sytokiinien eritykseen. Kontrolli- ja AME-ryhmistä eristettyjä pernasoluja kasvatettiin ja stimuloitiin anti-CD3-vasta-aineella (2 μg/ml) 48 h. (a) Pernasolujen proliferatiivinen vaste määritettiin MTS-määrityksellä. (b) Sytokiinien eritys 48 tunnin stimulaation jälkeen mitattiin ELISA-testillä. Pylväät kuvaavat keskiarvoa±SEM (n=6). (-): ilman anti-CD3-vasta-ainetta, (+): anti-CD3-vasta-ainekäsittely. # P <0.001 verrattuna kontrolliin (-), P <0.05 verrattuna kontrolliin (+).

4. Keskustelu

Traditionaalisessa kiinalaisessa lääketieteessä Qi:tä vahvistavien yrttien odotetaan tehostavan immuunijärjestelmää. Tässä tutkimuksessa keskityimme erityisesti sellaisten makrofagien ja T-solujen tulehdusreaktioihin, jotka eristettiin hiiristä, joille annettiin suun kautta AME:ta.

Thioglykolaatin aiheuttama steriili peritoniitti esiteltiin ensimmäisen kerran vuonna 1964 Gallily ym. toimesta, ja siitä lähtien se on ollut yleisimmin käytetty menetelmä primaaristen makrofagien eristämiseen . Neljäntenä päivänä vatsakalvonsisäisen tioglykolaatti-injektion jälkeen vatsakalvon eksudaatin solujen kokonaismäärä kasvaa noin viisinkertaiseksi . Näiden solujen joukossa makrofagit ovat vallitseva solutyyppi, jota seuraavat eosinofiilit . Vatsakalvomakrofagien lisääntyneen määrän lähde tioglykolaatti-injektion saaneissa hiirissä on luuytimestä peräisin olevat veren monosyytit . Monosyyttien erilaistumisen aikana monosyytistä makrofageiksi tapahtuu scavenger-reseptorien pregulaatio . Scavenger-reseptorit, yksi makrofagien synnynnäisten reseptorien tyyppi, ovat vastuussa fagosytoosista ja tunnistavat spesifisesti polyanionisia ligandeja . Käytimme CD11b:tä ja useita scavenger-reseptorimerkkiaineita monosyyttiperäisten makrofagien tunnistamiseen peritoneaalisen eksudaatin soluissa ja havaitsimme, että CD11b(+)SRA(+)-solupopulaatio lisääntyi merkittävästi AME-ryhmässä. Tämä viittaa siihen, että AME:n antaminen edistää veren monosyyttien rekrytoitumista ja erilaistumista makrofageiksi vasteena tioglykolaatille.

LPS:n tunnistaa tollin kaltainen reseptori (TLR)-4/MD-2-kompleksi. TLR4 indusoi tulehdusreaktioita kahden adaptorimolekyylin, MyD88:n ja TRIF:n, kautta. MyD88-riippuvainen signaalireitti aktivoi NF-κB:n ja mitogeeni-aktivoidun proteiinikinaasin (MAPK) indusoimaan tulehdusgeenejä, kuten TNF-α ja IL-6 . TRIF-riippuvainen signaalireitti aktivoi interferonin säätelytekijä-3:n tuottamaan IFN-β:tä, jota tarvitaan costimulatoristen molekyylien säätelyyn . TRIF-signalointireitti osallistuu myös NF-κB:n ja MAPK:n aktivoitumiseen, mutta MyD88-riippuvaiseen reittiin verrattuna viiveellä . Costimulatoristen molekyylien regulaatio on yksinomaan TRIF-riippuvainen, kun taas tulehdusreaktiot ovat riippuvaisia MyD88:sta ja TRIF:stä . AME-ryhmän makrofageilla ei ollut estävää vaikutusta testattuihin tulehdusmarkkereihin. Sen sijaan CD86:n ilmentyminen väheni. Makrofagien CD86 sitoo Th-solujen CD28:ta vahvistaakseen Th-solujen aktiivisuutta . Tuloksemme osoittavat, että AME:n oraalinen anto ei vaikuta NF-κB- ja MAPK-riippuvaisiin tulehdusreaktioihin makrofageissa, vaan häiritsee erityisesti TRIF-riippuvaista reittiä, joka johtaa ainoastaan CD86-ekspressioon. Lisätutkimuksia tarvitaan sen arvioimiseksi, aiheuttaako AME muutoksia patologisessa tilanteessa, jossa makrofagit ja Th-solut ovat vallitsevia.

LPS-stimuloitu makrofagijärjestelmä on hyvin yleinen in vitro -malli luonnontuotteiden tai lääkeaihioiden tulehdusta ehkäisevän vaikutuksen arvioimiseksi. Tätä mallia käyttämällä on helppo saada haluttu tulos lipidiliukoisilla komponenteilla, koska ne läpäisevät helposti solukalvon. Tietomme osoittivat, että peritoneaaliset makrofagit, jotka oli eristetty hiiristä, joille annettiin suun kautta AME:ta, eivät osoittaneet tulehdusta ehkäiseviä vaikutuksia ex vivo, mikä on ristiriidassa aiemmin raportoitujen in vitro -tulosten kanssa . Sitä vastoin AME:n anti-inflammatorinen vaikutus havaittiin seerumin TNF-α- ja IL-6-vasteessa LPS:n vatsakalvon sisäisen injektion jälkeen. Tämä systeeminen anti-inflammatorinen aktiivisuus välittyy vähiten todennäköisesti makrofagien moduloinnilla. Yksi in vivo- ja in vitro -olosuhteiden välisistä eroista on se, että LPS kulkeutuu verenkierrossa useiden lipoproteiinien mukana, minkä jälkeen hepatosyytit poistavat sen in vivo, kun taas tätä tapahtumaa ei voida jäljitellä in vitro . LPS:n puhdistuminen voi estää maksan makrofagien ylistimulaation . On vielä selvitettävä, liittyykö AME:n systeeminen anti-inflammatorinen vaikutus LPS:n puhdistumiseen maksassa. Samanlainen tulos saatiin vatsakalvomakrofageista, jotka eristettiin hiiristä, joille annettiin suun kautta Astragalus membranaceus -vesiuutetta (julkaisemattomat tiedot). Astragalus membranaceus ja AM kuuluvat samaan Qi:tä tonisoivaan yrttiluokkaan. Tällä hetkellä emme tiedä, onko in vivo tulehdusta ehkäisevä vaikutus, johon ei liity makrofagimodulaatiota, ainutlaatuinen näille lääkekasveille vai onko se yhteinen ominaisuus, jonka Qi-tonisoivat lääkekasvit voivat indusoida, ja meidän on kerättävä lisää tietoa voidaksemme tehdä johtopäätöksiä. Lisäksi Li et al. raportoivat, että atractylenolide I:llä ja 14-asetoksi-12-senecioyloxytetradeca-2E,8E,10E-trien-4,6-diyn-1-olilla, eräänlaisella AM:stä eristetyllä polyasetyleenisellä yhdisteellä, on molekyylirakenne, joka on vuorovaikutuksessa kalvoon sitoutuneen glukokortikoidireseptorin kanssa. Heidän tutkimuksensa mukaan 300 mg/kg suun kautta annettavaa atraktylenolidi I:tä ja 30 mg/kg suun kautta annettavaa polyasetyleeniä olivat pienimmät annokset, jotka olivat tarpeen tulehdusta ehkäisevien vaikutusten osoittamiseksi . Atractylenolide I:n määrä 2 500 mg/kg AME:ssa on vain 0,097 mg/kg, mikä on paljon alle vaaditun vähimmäisannoksen. Lisäksi polyasetyleenien on täytynyt hävitä AME:n valmistuksen aikana. On mahdollista, että AME sisältää tunnistamattomia glukokortikoidin kaltaisia yhdisteitä, jotka edistävät sen systeemistä anti-inflammatorista vaikutusta.

Kunnollisen immuunivasteen ylläpitämiseksi tarvitaan riittävä määrä T-soluja. Normaalioloissa T-solujen kokonaismäärää ylläpitävät naivien T-solujen muodostuminen kateenkorvassa sekä perifeeristen naivien T-solujen ja muisti-T-solujen vaihtuvuus. Hiirillä ja ihmisillä kateenkorva surkastuu iän myötä, ja vastaavasti naivien T-solujen tuotanto vähenee molemmilla lajeilla. Mitä tulee naivien T-solujen ylläpitoon, hiiret tuottavat kuitenkin naivia T-soluja koko elämänsä ajan, kun taas aikuiset ihmiset ylläpitävät tätä populaatiota perifeeristen naivien T-solujen jakautumisen avulla . Lisäksi hiiren naivien T-solujen elinikä on 40 kertaa lyhyempi kuin ihmisen vastaavien solujen . Muisti-T-soluja ylläpidetään ajoittaisella jakautumisella . Naivien ja muisti-T-solujen tarkkaa eloonjäämis- ja homeostaattista lisääntymismekanismia ei ole täysin määritelty, mutta siihen liittyy TCR/MHC-kompleksin ja sytokiinien, kuten IL-7:n ja IL-15:n, signaaleja. Rokotteiden pitkäaikainen vaikutus on riippuvainen muisti-T-soluista, kun taas lymfopeenisten sairauksien hoitoon tarvitaan naiiveja T-soluja. Emme määritelleet, koostuiko pernan CD4-T-solupopulaatio, joka lisääntyi AME-hoidon yhteydessä, naivista CD4-T-soluista vai muistin CD4-T-soluista. AME:hen reagoivan solufraktion yksityiskohtainen karakterisointi auttaa määrittelemään, kumpi tilanne soveltuu paremmin AME:n soveltamiseen.

Huomattakoon, että AME-ryhmässä tapahtui samanaikaista MHC-luokan II molekyylien regulaatiota pernassa. MHC-luokan II molekyylit ovat välttämättömiä antigeenien tarjoamiseksi CD4-T-soluille. Rutiininomaisesti havaitsimme, että suurin osa pernan MHC-luokkaa II ilmentävistä soluista on B-soluja ja loput makrofageja ja dendriittisoluja. Emme selvittäneet, mitkä solutyypit osoittivat MHC-luokan II molekyylien regulaatiota AME:n antamisen jälkeen. Sekä CD4-T-solujen lukumäärän että MHC-luokan II molekyylien ilmentymisen lisääntyminen pernassa osoittaa kuitenkin, että AME:n lisäannos edistää CD4-T-solujen systeemistä ylläpitoa. IL-4:n tehtävänä fysiologisissa olosuhteissa on tehostaa vasta-ainevastausta edistämällä B-solujen eloonjäämistä ja lisääntymistä ja tarjoamalla suojaa helmintti-infektioita vastaan. AME-ryhmien pernasolut osoittivat lisääntynyttä IL-4-tuotantoa T-solujen aktivaation aikana ex vivo ja samalla vähentynyttä IFN-γ-tuotantoa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että normaalioloissa AME edistää Th2-vastetta. Sitä vastoin AM-peräisen glykoproteiinin oraalinen anto edistää Th1-vastetta ja vähentää Th2-vastetta allergisessa mallissa . Ei ole selvää, edustaako tämä yhdiste AM:n koko aktiivisuutta. Tarvitaan lisätutkimuksia sen selvittämiseksi, estääkö vai pahentaako AME patologisia Th2-vasteita.

5. Päätelmät

Tässä tutkimuksessa havaitsimme muutoksia makrofagien ja T-solujen vasteissa normaaleilla hiirillä AME:n oraalisen annon jälkeen. AME lisäsi tioglykolaatin indusoimaa monosyyttien erilaistumista peritoneumissa ja vaimensi LPS:n indusoimia TNF-α- ja IL-6-tasoja seerumissa. Toisin kuin näissä systeemisissä anti-inflammatorisissa vaikutuksissa, AME-ryhmästä eristetyissä makrofageissa ei ollut havaittavissa anti-inflammatorisia vaikutuksia lukuun ottamatta muutoksia costimulatoristen molekyylien ilmentymisessä. AME vaikutti myös adaptiiviseen immuunijärjestelmään lisäämällä CD4-T-solujen määrää ja MHC-luokan II molekyylien ilmentymistä sekä edistämällä Th2-vastetta Th1-vasteen sijaan.

Lyhenteet

AM:	Atractylodes macrocephala Koidz
AME:	AM vesiuute
LPS:	Lipopolysakkaridi
TNF-α:	Tuumorinekroositekijä-α
IL:	Interleukiini
APC:	Antigeenia esittävä solu
TCR:	T-solureseptori
MHC:	Major histokompatibiliteettikompleksi
Th-solu:	T auttajasolu
DW:	Deionisoitu vesi
FBS:	Fetal bovine serum
PBS:	Fosfaattipuskuroitu keittosuolaliuos
iNOS:	Indusoituva typpioksidisyntaasi
COX-2:	Syklooksigenaasi-2
TLR:	Tollin kaltainen reseptori
IFN-γ:	Interferoni-γ
MAPK:	Mitogeeni-aktivoitu proteiinikinaasi.

Tietojen saatavuus

Tämän tutkimuksen tulosten tukena käytetyt tiedot ovat pyynnöstä saatavissa vastaavalta kirjoittajalta.

Interintäristiriidat

Tekijät ilmoittavat, ettei heillä ole eturistiriitoja.

Kiitokset

Tämä tutkimus sai tukea opetusministeriön rahoittamasta Korean kansallisen tutkimussäätiön kautta toteutettavasta perustutkimusohjelmasta (2014R1A1A2055052).