Tandem-massaspektrometria

Gasufaasi-ionien fragmentaatio on olennaista tandem-massaspektrometriassa, ja se tapahtuu massa-analyysin eri vaiheiden välillä. Ionien fragmentointiin käytetään monia menetelmiä, ja ne voivat johtaa erityyppiseen fragmentoitumiseen ja siten erilaiseen informaatioon molekyylin rakenteesta ja koostumuksesta.

Lähteessä tapahtuva fragmentointiEdit

Usein ionisointiprosessi on riittävän voimakas, jotta syntyvillä ioneilla on riittävästi sisäistä energiaa fragmentoitua massaspektrometrissä. Jos tuoteionit pysyvät epätasapainotilassaan kohtalaisen kauan ennen automaattista dissosioitumista, tätä prosessia kutsutaan metastabiiliksi fragmentaatioksi. Nozzle-skimmer-fragmentaatiolla tarkoitetaan lähteen sisäisen fragmentaation tarkoituksellista aikaansaamista lisäämällä suuttimen ja skimmerin potentiaalia tavallisesti sähkösumutukseen perustuvissa laitteissa. Vaikka lähteen sisäinen fragmentaatio mahdollistaa fragmentaatioanalyysin, se ei ole teknisesti tandem-massaspektrometriaa, ellei metastabiileja ioneja analysoida tai valita massaa ennen automaattista dissosiaatioanalyysia ja ellei tuloksena oleville fragmenteille suoriteta toista analyysivaihetta. In-source-fragmentointia voidaan käyttää tandem-massaspektrometrian sijasta käyttämällä Enhanced in-Source Fragmentation Annotation (EISA) -tekniikkaa, joka tuottaa fragmentaatiota, joka vastaa suoraan tandem-massaspektrometriatietoja. EISA:lla havaituilla fragmenteilla on suurempi signaalin intensiteetti kuin perinteisillä fragmenteilla, jotka kärsivät tappioita tandem-massaspektrometrien törmäyskennoissa. EISA mahdollistaa fragmentointidatan hankinnan MS1-massa-analysaattoreilla, kuten aika-ajolento- ja yksikvadrupolilaitteilla. In-source-fragmentointia käytetään usein tandem-massaspektrometrian (jossa on post-source-fragmentointi) lisäksi, jotta pseudo-MS3-tyyppisessä kokeessa voidaan käyttää kahta fragmentointivaihetta.

Törmäysindusoitu dissosiaatio Muokkaa

Post-source-fragmentointi on useimmiten se, mitä tandem-massaspektrometriakokeessa käytetään. Ioneihin, jotka ovat yleensä jo valmiiksi värähtelyherätteisiä, voidaan lisätä energiaa myös lähteen jälkeisillä törmäyksillä neutraalien atomien tai molekyylien kanssa, säteilyn absorptiolla tai elektronin siirrolla tai vangitsemisella moninkertaisesti varautuneen ionin toimesta. Törmäysindusoitu dissosiaatio (Collision-induced dissociation, CID), jota kutsutaan myös törmäysaktivoiduksi dissosiaatioksi (Collisionally Activated Dissociation, CAD), käsittää ionin törmäyksen neutraalin atomin tai molekyylin kanssa kaasufaasissa ja sitä seuraavan ionin dissosioitumisen. Tarkastellaan esimerkiksi

AB + + M ⟶ A + B + + + M {\displaystyle {\ce {{AB+}+ M -> {A}+ {B+}+ M}}})

jossa ioni AB+ törmää neutraaliin lajiin M ja hajoaa sen jälkeen. Tämän prosessin yksityiskohdat kuvataan törmäysteorialla. Erilaisten instrumenttikonfiguraatioiden vuoksi kaksi erilaista CID-tyyppiä ovat mahdollisia: (i) säteen tyyppinen (jossa prekursori-ionit fragmentoituvat lennon aikana) ja (ii) ioniloukku-tyyppinen (jossa prekursori-ionit ensin loukkuun ja sitten fragmentoituvat).

Kolmas ja uudempi CID-fragmentointitapa on korkeamman energian törmäysdissosiaatio (HCD). HCD on orbitrap-massaspektrometreille ominainen CID-tekniikka, jossa fragmentaatio tapahtuu ioniloukun ulkopuolella, se tapahtuu HCD-kennossa (joissakin laitteissa nimeltään ”ionireitin monipooli”). HCD on ansatyyppinen fragmentointi, jolla on osoitettu olevan säteen tyyppisiä ominaisuuksia. On olemassa vapaasti saatavilla olevia laajamittaisia korkean resoluution tandem-massaspektrometriatietokantoja (esim. METLIN, jossa on 850 000 molekyylistandardia, joista jokaisessa on kokeelliset CID MS/MS-tiedot), ja niitä käytetään yleensä pienten molekyylien tunnistamisen helpottamiseksi.

Elektronin kaappaus- ja siirtomenetelmätEdit

Vapautuva energia, joka vapautuu, kun elektroni siirretään moninkertaisesti varautuneeseen ioniin tai se kaapataan moninkertaisesti varautuneeseen ioniin, voi aiheuttaa fragmentoitumista.

Elektronin kaappausdissosiaatioEdit

Jos moninkertaisesti varautuneeseen positiiviseen ioniin liitetään elektroni, vapautuu Coulombin energiaa. Vapaan elektronin lisäämistä kutsutaan elektronin sieppauksen aiheuttamaksi dissosiaatioksi (ECD), ja se esitetään seuraavalla kaavalla

n + + e – ⟶ ( n – 1 ) + ] ∗ ⟶ fragmentit {\displaystyle ^{n+}+{\ce {e^{-}->}}}\left^{(n-1)+}\right]^{*}{\ce {->fragmentit}}}}

moninkertaisesti protonoidulle molekyylille M.

ElektroninsiirtodissosiaatioEdit

Elektronin lisäämistä ioni-ionireaktion kautta kutsutaan elektroninsiirtodissosiaatioksi (ETD). Samanlainen kuin elektronin sieppauksen dissosiaatio, ETD saa aikaan kationien (esim. peptidien tai proteiinien) pirstoutumisen siirtämällä niihin elektroneja. Sen keksivät Donald F. Hunt, Joshua Coon, John E. P. Syka ja Jarrod Marto Virginian yliopistossa.

ETD:ssä ei käytetä vapaita elektroneja, vaan siihen käytetään radikaali-anioneja (esim. antraseenia tai atsobentseeniä):

n + + A – ⟶ ( n – 1 ) + ] ∗ + A ⟶ fragments {\displaystyle ^{n+}+{\ce {A^{-}->}}}\left^{(n-1)+}\right]^{*}+{\ce {A->fragments}}}}

jossa A on anioni.

ETD pilkkoo sattumanvaraisesti pitkin pitkin peptidien selkärankaa (c- ja z-ionit), kun taas sivuketjuja ja modifikaatioita, kuten fosforylaatioita, jätetään ehjiksi. Tekniikka toimii hyvin vain korkeamman varaustilan ioneille (z>2), mutta suhteessa törmäysindusoituun dissosiaatioon (CID) ETD on edullinen pidempien peptidien tai jopa kokonaisten proteiinien fragmentoinnissa. Tämän vuoksi tekniikka on tärkeä top-down-proteomiikan kannalta. Samoin kuin ECD, ETD on tehokas peptideille, joissa on modifikaatioita, kuten fosforylaatioita.

Elektroninsiirto- ja korkeamman energian törmäysdissosiaatio (EThcD) on yhdistelmä ETD:stä ja HCD:stä, jossa peptidien esiaste altistetaan aluksi ioni-ionireaktiolle lineaarisessa ioninloukussa fluoranteeni-anionien kanssa, mikä tuottaa c- ja z-ioneja. Toisessa vaiheessa kaikkiin ETD:stä peräisin oleviin ioneihin sovelletaan HCD:n täysionifragmentointia b- ja y-ionien tuottamiseksi ennen lopullista analyysia orbitrap-analysaattorissa. Tässä menetelmässä käytetään kaksoisfragmentaatiota ioni- ja siten datarikkaiden MS/MS-spektrien tuottamiseksi peptidien sekvensointia ja PTM-lokalisointia varten.

Negatiivinen elektroninsiirtodissosiaatio Muokkaa

Fragmentaatiota voi tapahtua myös deprotonoidun lajin kanssa, jolloin elektroni siirretään lajista kationiseen reagenssiin negatiivisessa elektroninsiirtodissosiaatiossa (NETD, Negative Electron Transfer Dissociation):

n – + + A + ⟶ ( n + 1 ) – ] ∗ + A ⟶ fragmentit {\displaystyle ^{n-}+{\ce {A+->}}\left^{(n+1)-}\right]^{*}+{\ce {A->fragmentit}}}}

Tämän siirtotapahtuman jälkeen elektronivajeinen anioni käy läpi sisäisen uudelleenjärjestäytymisen ja fragmentoituu. NETD on elektronin irtoamisdissosiaation (EDD, electron-detachment dissociation) ioni/ioni -analogi.

NETD soveltuu peptidien ja proteiinien fragmentoitumiseen pitkin selkärankaa Cα-C-sidoksen kohdalla. Syntyvät fragmentit ovat yleensä a– ja x-tyyppisiä tuoteioneja.

Electron-detachment dissociationEdit

Electron-detachment dissociation (EDD) on menetelmä anionisten lajien fragmentoimiseksi massaspektrometriassa. Se toimii negatiivisena vastamoodina elektronikaappausdissosiaatiolle. Negatiivisesti varautuneet ionit aktivoidaan säteilyttämällä niitä elektronilla, jonka liike-energia on kohtalainen. Tuloksena on elektronien poistuminen emoionimolekyylistä, mikä aiheuttaa dissosioitumisen rekombinaation kautta.

Varauksensiirtodissosiaatio Muokkaa

Positiivisesti varautuneiden peptidien ja kationisten reagenssien välinen reaktio, joka tunnetaan myös nimellä varauksensiirtodissosiaatio (charge transfer dissociation, CTD), on hiljattain osoitettu vaihtoehtoiseksi korkea-energiseksi fragmentaatioväyläksi matalalataustaisille (1+- tai 2+-luokkaa oleville) peptideille. CTD:n ehdotettu mekanismi käyttäen heliumkationeja reagenssina on:

1 + + He + ⟶ 2 + ] ∗ + He 0 ⟶ fragmentit {\displaystyle {\ce {{^{1}+}+He+->}}}\left^{2}+}}}\right]^{*}+{\ce {He^{0}->fragmentit}}}}

Alustavien raporttien mukaan CTD aiheuttaa peptidien selkärangan Cα-C-sidosten pilkkoutumista ja tuottaa a– ja x-tyyppisiä tuoteioneja.

FotodissosiaatioEdit

Dissosiaatioon tarvittavaa energiaa voidaan lisätä fotonien absorptiolla, jolloin syntyy ionin fotodissosiaatio, jota edustaa

AB + + h ν ⟶ A + B + {\displaystyle {\ce {{AB+}+{\mathit {h\nu }}->{A}+B+}}}}}

jossa h ν {\displaystyle h\nu }

edustaa ionin absorboimaa fotonia. Ultraviolettilasereita voidaan käyttää, mutta ne voivat johtaa biomolekyylien liialliseen pirstoutumiseen.

Infrapuna-monifotonidissosiaatioEdit

Infrapunafotonit lämmittävät ioneja ja aiheuttavat dissosiaation, jos niitä absorboituu riittävästi. Tätä prosessia kutsutaan infrapuna-monifotonidissosiaatioksi (IRMPD), ja se toteutetaan usein hiilidioksidilaserilla ja ioniloukkuun perustuvalla massaspektrometrillä, kuten FTMS:llä.

Mustan kappaleen infrapunasäteilydissosiaatioEdit

Mustan kappaleen säteilyä voidaan käyttää fotodissosiaatioon tekniikassa, joka tunnetaan nimellä mustan kappaleen infrapunasäteilydissosiaatio (blackbody infrared radiative dissociation, BIRD). BIRD-menetelmässä koko massaspektrometrin tyhjiökammio kuumennetaan infrapunavalon tuottamiseksi. BIRD-menetelmässä tätä säteilyä käytetään herättämään ionien yhä energisempiä värähtelyjä, kunnes sidos katkeaa ja syntyy fragmentteja. Tämä on samankaltaista kuin infrapunamultifotonidissosiaatio, jossa myös käytetään infrapunavaloa, mutta eri lähteestä. BIRD:tä käytetään useimmiten Fourier-muunnosionisyklotroniresonanssimassaspektrometriassa.

Pintaindusoitu dissosiaatio Muokkaa

Pintaindusoidussa dissosiaatiossa (SID, surface-induced dissociation) fragmentoituminen on seurausta ionin törmäämisestä pintaan korkeassa tyhjiössä. Nykyään SID:tä käytetään monenlaisten ionien fragmentointiin. Vuosia sitten SID:tä käytettiin yleisesti vain pienemmän massan yksivaratuille lajeille, koska ionisaatiomenetelmät ja massa-analysaattoritekniikat eivät olleet riittävän kehittyneitä muodostamaan, välittämään tai karakterisoimaan korkeiden m/z-arvojen ioneja asianmukaisesti. Ajan mittaan itsekootut monokerrospinnat (SAM), jotka koostuvat kullan päällä olevasta CF3(CF2)10CH2CH2CH2S:stä, ovat olleet näkyvimmin käytettyjä törmäyspintoja SID:lle tandemspektrometrissä. SAM:t ovat toimineet halutuimpina törmäyskohteina, koska niille on ominaista suuri tehollinen massa saapuvien ionien törmäyksessä. Lisäksi nämä pinnat koostuvat jäykistä fluorihiiliketjuista, jotka eivät merkittävästi vaimenna ammusionien energiaa. Fluorihiiliketjuista on hyötyä myös siksi, että ne vastustavat helppoa elektronien siirtymistä metallipinnalta saapuviin ioneihin. Mikään muu dissosiaatiotekniikka ei vedä vertoja SID:n kyvylle tuottaa alakomplekseja, jotka pysyvät stabiileina ja antavat arvokasta tietoa kytkeytyneisyydestä. Koska SID:llä tuotetut kompleksit ovat stabiileja ja säilyttävät varauksen jakautumisen fragmenttiin, tämä tuottaa ainutlaatuisen spektrin, jossa kompleksi keskittyy kapeamman m/z-jakauman ympärille. SID-tuotteet ja energia, jolla ne muodostuvat, heijastavat kompleksin vahvuuksia ja topologiaa. Ainutlaatuiset dissosiaatiomallit auttavat löytämään kompleksin kvaternäärirakenteen. Symmetrinen varausjakauma ja dissosiaatioriippuvuus ovat ainutlaatuisia SID:lle, ja ne tekevät tuotetuista spektreistä muista dissosiaatiotekniikoista poikkeavia.

SID-tekniikkaa voidaan soveltaa myös ioniliikkuvuusmassaspektrometriaan (IM-MS). Tämän tekniikan kolme erilaista menetelmää sisältävät topologian, alayksiköiden välisen kytkeytyneisyyden ja proteiinirakenteen taittumisasteen karakterisoinnin analysoinnin. Proteiinirakenteen taittumisen analysointi on SID-tekniikan yleisimmin käytetty sovellus. Ioniliikkuvuusmassaspektrometriassa (IM-MS) SID-tekniikkaa käytetään kolmen erityyppisen proteiinikompleksin lähdeaktivoitujen esiasteiden dissosiaatioon: C-reaktiivinen proteiini (CRP), transtyretiini (TTR) ja konkanavaliini A (Con A). Tätä menetelmää käytetään kunkin kompleksin taittumisasteen havainnointiin. Tätä havainnointia varten SID osoitti prekursori-ionien rakenteet, jotka ovat olemassa ennen törmäystä pinnan kanssa. IM-MS käyttää SID:ää suorana mittauksena kunkin proteiinin alayksikön konformaatiosta.

Fourier-transformaatio-ionisyklotroniresonanssi (FTICR) pystyy tarjoamaan ultrakorkean resoluution ja suuren massatarkkuuden massamittauksia tekeville laitteille. Nämä ominaisuudet tekevät FTICR-massaspektrometreistä hyödyllisen työkalun monenlaisiin sovelluksiin, kuten useisiin dissosiaatiokokeisiin, kuten törmäysindusoituun dissosiaatioon (CID), elektronisiirtodissosiaatioon (ETD) ja muihin. Lisäksi tällä laitteella on toteutettu pintaindusoitu dissosiaatio peptidifragmentaation perustutkimusta varten. Erityisesti SID:tä on sovellettu kaasufaasifragmentaation energetiikan ja kinetiikan tutkimiseen ICR-laitteessa. Tätä lähestymistapaa on käytetty protonoitujen peptidien, parittoman elektronin peptidi-ionien, ei-kovalenttien ligandi-peptidikompleksien ja ligoitujen metalliklustereiden kaasufaasifragmentaation ymmärtämiseen.