Significance
Vanhenemisen täsmällisiä syitä ei vieläkään ymmärretä, ja on epäselvää, miksi jotkin lajit elävät alle 1 d, kun taas toiset lajit voivat elää yli 400 v. Tutkimukset viittaavat siihen, että telomeerit liittyvät vanhenemisprosessiin, mutta selkeää suhdetta lajin eliniän ja telomeerien alkuperäisen pituuden välillä ei ole havaittu. Tässä tutkimuksessa mittaamme telomeerien pituuksia useilla eri lajeilla. Huomaamme, että lajin eliniän ja telomeerien alkupituuden välillä ei itse asiassa ole vahvaa korrelaatiota. Löydämme kuitenkin vahvan korrelaation telomeerien lyhenemisnopeuden ja lajin eliniän välillä.
Abstract
Telomeerien lyheneminen kriittiseen pituuteen voi laukaista ikääntymisen ja lyhyemmän eliniän hiirillä ja ihmisillä mekanismilla, johon liittyy pysyvän DNA-vaurioreseptin indusoituminen kromosomien päissä ja solujen elinvoimaisuuden menetys. Ei kuitenkaan tiedetä, onko telomeerien pituus yleinen lajin eliniän määräävä tekijä. Määrittääksemme, voiko telomeerien lyheneminen olla yksittäinen parametri, jonka avulla voidaan ennustaa lajien eliniän pituutta, mittasimme rinnakkain telomeerien pituutta monilla eri lajeilla (linnut ja nisäkkäät), joilla on hyvin erilainen elinikä ja ruumiinkoko, mukaan lukien hiiri (Mus musculus), vuohi (Capra hircus), Audouinin lokki (Larus audouinii), poro (Rangifer tarandus), korppikotka (Gyps fulvus), pullonokkadelfiini (Tursiops truncatus), amerikanflamingo (Phoenicopterus ruber) ja sumatranelefantti (Elephas maximus sumatranus). Havaitsimme, että telomeerien lyhenemisnopeus, mutta ei pelkkä telomeerien alkupituus, on voimakas lajin eliniän ennustava tekijä. Nämä tulokset tukevat käsitystä siitä, että telomeerien kriittinen lyheneminen ja siitä seuraava telomeerien DNA-vaurioiden ja solujen vanhenemisen alkaminen ovat yleinen lajin elinikää määrittävä tekijä.
- telomeeri
- elinaika
- laji
Ihmisillä on suhteellisen lyhyet telomeerien pituudet, jotka vaihtelevat 5 ja 15 kb:n välillä (1⇓-3), ja silti ihmisillä on paljon pidempi elinikä kuin hiirillä, joilla telomeerien pituus voi olla aluksi n. 50 kb (4, 5). Aiemmissa tutkimuksissa on esitetty, että telomeerien lyhenemisnopeus eikä niinkään telomeerien alkupituus on kriittinen muuttuja, joka määrittää lajien elinajan (4, 6⇓⇓⇓⇓⇓-10). Erityisesti olemme aiemmin osoittaneet, että ihmisen telomeerit lyhenevät ∼70 bp per vuosi (1), mikä vastaa muiden kirjoittajien julkaisemaa nopeutta (3, 11⇓⇓-14), kun taas hiirten telomeerit lyhenevät 7000 bp per vuosi (4). Nämä erilaiset telomeerien lyhenemisnopeudet ihmisen ja hiiren välillä voisivat selittää hiirten ja ihmisten erilaisen eliniän. Telomeerien lyhenemisnopeutta on kuitenkin tähän mennessä tutkittu vain harvoilla lajeilla (4, 6⇓⇓⇓⇓-10, 15, 16) ja erilaisilla tekniikoilla, mikä on estänyt telomeerien lyhenemisnopeuksien rinnakkaisvertailun fylogeneettisesti kaukana toisistaan olevilla lajeilla, joilla on erilainen ruumiinkoko ja elinikä.
Tässä selvittääksemme, voisivatko telomeerien pituus ja/tai telomeerien lyhenemisnopeus selittää lajien pitkäikäisyyttä, mittasimme telomeerien pituuden perifeerisen veren mononukleaarisoluista eri lintu- ja nisäkäslajien yksilöiltä eri-ikäisinä rinnakkain ja laskimme telomeerien lyhenemisnopeuden vuotta kohden kussakin lajissa. Telomeerien pituuden pitkittäistutkimusta ei tässä yhteydessä tarkasteltu, koska tutkimuksessa mukana olleiden lajien eliniät olivat hyvin erilaiset. Tulevissa tutkimuksissa tällainen analyysi on perusteltua, jotta telomeerien dynamiikkaa voidaan ymmärtää yksilötasolla. Telomeerien pituuden mittaamiseksi käytimme tässä tutkimuksessa korkean läpimenon kvantitatiivista fluoresenssi-in situ -hybridisaatiotekniikkaa (HT Q-FISH), jonka avulla voidaan kvantifioida yksittäisiä telomeerisignaaleja yksittäisen solun tasolla (1), mikä antaa tietoja sekä telomeerien keskimääräisestä pituudesta että yksittäisistä telomeerisignaaleista (SI-liite, taulukko S1 ja kuva 1) (17, 18). Erityisesti mittasimme rinnakkain laboratoriohiirien (Mus musculus) (kuva 1A), pullonokkadelfiinien (Tursiops truncatus) (kuva 1B), vuohien (Capra hircus) (kuva 1C), porojen (Rangifer tarandus) (kuva 1B), vuohien (Capra hircus) (kuva 1C) ja porojen (Rangifer tarandus) (kuva 1B) telomeerejä. 1D), amerikanflamingot (Phoenicopterus ruber) (kuva 1E), korppikotkat (Gyps fulvus) (kuva 1F), pikkulokit (Larus audouinii) (kuva 1G) ja sumatranelefantit (Elephas maximus sumatranus) (kuva 1H). Laboratoriohiiret otettiin mukaan kontrolliksi, koska olimme aiemmin osoittaneet telomeerien lyhenemisnopeuden olevan noin 7 000 bp vuodessa, mikä on 100-kertaisesti nopeampi kuin ihmisillä raportoitu lyhenemisnopeus (4). Eri tutkittavien lajien telomeerien alkuperäistä pituutta arvioitiin lineaarisella regressiolla (kuva 1). On huomattava, että telomeerin alkupituuden arvo on vain arvio ja telomeerin pituuden dynamiikka ei välttämättä ole lineaarinen elämän alkuvaiheessa (19). Ensinnäkin vahvistimme, että telomeerien lyhenemisnopeus oli nykyisessä hiirikohortissamme erittäin korkea, 6 420 bp/vuosi (kuva 1A), mikä on samanlainen kuin aiemmin kuvaamamme nopeus (4). Pullonokkadelfiineillä telomeerien lyhenemisnopeus oli 766 bp/vuosi (SI-liite, taulukko S1 ja kuva 1B) ja telomeerien arvioitu alkuperäinen pituus noin 90,7 kb (kuva 1B). Vuohien telomeerien lyhenemisnopeus oli 363 bp vuodessa (kuva 1C) ja telomeerien arvioitu alkuperäinen pituus noin 10,4 kb. Porojen telomeerien lyhenemisnopeus oli 531 bp per vuosi (kuva 1D) ja telomeerien arvioitu alkuperäinen pituus ∼ 19,8 kb. Amerikkalaisilla flamingoilla telomeerien lyhenemisnopeus oli 105 bp vuodessa (kuva 1E) ja telomeerien arvioitu alkuperäinen pituus noin 21,0 kb. Greippikorppien telomeerien lyhenemisnopeus oli 209 bp per vuosi (kuva 1F) ja telomeerien arvioitu alkuperäinen pituus noin 19,8 kb. Audouinin lokkien telomeerien lyhenemisnopeus oli 771 bp vuodessa (kuva 1G) ja telomeerien arvioitu alkuperäinen pituus noin 35 kb. Sumatran elefanttien telomeerien lyhenemisnopeus oli 109 bp vuodessa (kuva 1H) ja telomeerien arvioitu alkuperäinen pituus noin 36,3 kb. Haaskalintujen ja Sumatran elefanttien tapauksessa käytössämme oli vain muutama Madridin eläintarhassa saatavilla oleva yksilö, joten näissä tapauksissa saatuja arvoja olisi pidettävä ensimmäisenä likiarvona telomeerien lyhenemisnopeudesta näissä lajeissa.
Telomeerimittaukset eri lajeilla. Telomeerit mitattiin HT Q-FISH:llä eri-ikäisiltä yksilöiltä (A) hiiriltä (Mus musculus), (B) pullonokkadelfiineiltä (Tursiops truncatus), (C) vuohilta (Capra hircus), (D) poroilta (Rangifer tarandus), (E) amerikanflamingot (Phoenicopterus ruber), (F) korppikotkat (Gyps fulvus), (G) Audouinin lokki (Larus audouinii) ja (H) Sumatran norsut (Elephas maximus sumatranus). Kukin piste edustaa eri yksilön arvoja. Korrelaatiokerroin (R2), kaltevuus (telomeerien lyhenemisnopeus kilobaseina vuodessa) ja y-leikkaus (telomeerien alkupituus) on esitetty kuvaajissa.
Seuraavaksi tutkimme telomeerien pituuden, telomeerien lyhenemisnopeuden ja lajin eliniän välisiä suhteita. Lajien maksimielinaikojen määrittämiseen käytimme AnAge-tietokantaa (20). Keskimääräiset elinajat saatiin eri lähteistä (SI-liite, taulukko S1). Ensinnäkään emme havainneet korrelaatiota arvioidun alkuperäisen telomeerin pituuden ja lajien eliniän välillä (Kuva 2 A-D). Erityisesti lajin maksimaalisen elinajan ja arvioidun alkutelomeerin pituuden välinen kuvaaja antoi lineaarisella regressiokäyrällä R2-arvon 0,0190 (kuva 2A) ja potenssilakiin perustuvalla regressiokäyrällä R2-arvon 0,0407 (kuva 2B). Lajin keskimääräisen eliniän ja arvioidun alkuperäisen telomeeripituuden välinen kuvaaja antoi R2-arvoksi 0,125 lineaarisella regressiokäyrällä (kuva 2C) ja R2-arvoksi 0,145 potenssilain regressiokäyrällä (kuva 2D). Huomattakoon, että on jopa havaittavissa suuntaus lyhyempään elinikään pidemmillä alkutelomeerien pituuksilla, jolloin juuri mainitut alhaiset R2-arvot ja negatiiviset kaltevuudet regressiosuoran yhtälöissä (kuvat 2 A-D). Huomaa myös, että keskimääräisen elinajan ja alkutelomeerin pituuden välinen käänteinen korrelaatio (R2 = 0,125; kuva 2C) oli parempi kuin maksimaalisen elinajan ja alkutelomeerin pituuden välinen korrelaatio (R2 = 0,019; kuva 2A). Nämä havainnot vastaavat aiempaa tutkimusta, jossa vertailtiin telomeerien pituutta yli 60 eri lajilla (21). Vaikka telomeerien lyhenemisnopeutta ei mitattu kyseisessä tutkimuksessa, kirjoittajat päättelivät, että lajin elinikää ei voitu ennustaa alkuperäisen telomeerin pituuden perusteella ja että lyhytikäisillä lajeilla oli suuntaus, että telomeerit olivat pidempiä (21).
Lajien elinajan ennusteet telomeeriparametrien avulla I. (A) Maksimaalinen elinikä vs. arvioitu alkuperäinen telomeerin pituus sovitettuna lineaarisella regressiosuoralla. (B) Maksimaalinen elinikä vs. arvioitu alkuperäinen telomeerin pituus, joka on sovitettu potenssilain regressiosuoralla. (C) Keskimääräinen elinikä vs. arvioitu alkuperäinen telomeerin pituus sovitettuna lineaarisella regressiosuoralla. (D) Keskimääräinen elinikä vs. arvioitu alkutelomeerin pituus sovitettuna potenssilain regressiosuoralla. (E) Maksimaalinen elinikä vs. telomeerien lyhenemisnopeus. (F) Ennustettu elinikä vs. maksimaalinen elinikä. Ennustettu elinikä lasketaan käyttämällä telomeerien lyhenemisnopeutta E:n potenssilain regressioyhtälössä. (G) Keskimääräinen elinikä vs. telomeerien lyhenemisnopeus. (H) Ennustettu elinikä vs. keskimääräinen elinikä. Ennustettu elinikä on laskettu käyttämällä telomeerien lyhenemisnopeutta potenssilakiin perustuvassa regressioyhtälössä G:stä.
Mielenkiintoista on, että kun piirsimme eri lajien maksimaalisen elinajan ja telomeerien lyhenemisnopeuden välille, saimme potenssilakiin perustuvan käyrän, jonka R2-arvo oli 0,829 (kuva 2E). Tämän käyrän yhtälön avulla voidaan ennustaa lajin elinikä, kun telomeerien lyhenemisnopeus annetaan ilman, että käytetään mitään tietoa telomeerien alkuperäisestä pituudesta; R2-arvo on 0,782 (kuva 2F). Samat kuvaajat voidaan tehdä käyttämällä keskimääräistä elinikää maksimaalisen eliniän sijasta (kuvat 2 G ja H), ja tässä tapauksessa potenssilakikäyrän R2-arvo on 0,934. Havainto siitä, että elinikä suhteessa telomeerien lyhenemisnopeuteen sopii potenssilakikäyrään, on sopusoinnussa monien luonnonilmiöiden kanssa, jotka sopivat joko potenssilakiin tai eksponentiaaliseen käyrään, kuten muun muassa väestönkasvu, lämpötilan jäähtyminen/lämpeneminen, kaupunkien koot, lajien sukupuuttoon kuoleminen, ruumiin massa, yksittäisten ihmisten tulot ja solmujen yhteyksien määrä mittakaavattomassa verkostossa (22⇓⇓-25).
Vaihtoehtoisesti voidaan tehdä lineaarisempia eliniän ennusteita käyttämällä sekä telomeerien alkuperäistä pituutta että telomeerien lyhenemisnopeutta. Tällöin vaikuttaa epätodennäköiseltä, että lajit kuolevat, kun niiden telomeerit ovat täysin rapautuneet, koska telomeerien täydellisen rapautumisen ennustamat elinajat ovat pidempiä kuin useimpien lajien havaitut elinajat (SI-liite, taulukko S1). Sen sijaan havaitsemme tässä, että telomeerien pituus, kun lajit kuolevat maksimaalisen elinajan iässä, näyttää olevan ∼50 % kyseisen lajin alkuperäisestä telomeerien pituudesta, kun tarkastellaan kaikkien mitattujen lajien keskiarvoa (SI-liite, taulukko S2). Mielenkiintoista on, että kun tarkastellaan keskimääräisen elinajan ajankohtaa, telomeerin pituus näyttää olevan ∼75 % alkuperäisestä pituudesta (SI-liite, taulukko S2). Voimme siis laskea lajin eliniän, jos oletamme, että telomeerit lyhenevät tasaisella lineaarisella nopeudella ja että kuolema tapahtuu, kun telomeerit ovat lyhentyneet 50 tai 75 prosenttiin alkuperäisestä telomeerien pituudesta. Yhtälö arvioidulle eliniälle, jos telomeerit lyhenevät 50 prosenttiin alkuperäisestä pituudesta, on seuraava: ((Alkuperäinen telomeerien pituus) – (Alkuperäinen telomeerien pituus) × 0,5)/Telomeerien lyhenemisnopeus. Arvioidun eliniän 50 %:n alkuperäisellä telomeerien pituudella ja maksimieliniän välinen kuvaaja antaa R2:n arvoksi 0,565 (kuva 3A). Arvioitu elinikä 50 %:n alkuperäisellä telomeerin pituudella vs. keskimääräinen elinikä antaa R2:n, joka on 0,694 (kuva 3B). Samanlaiset kuvaajat esitetään 75 prosentin alkuperäisen telomeeripituuden osalta (kuvat 3 C ja D). Tässä tietokokonaisuudessa kuvaaja, jossa 75 %:n alkuperäinen telomeerin pituus vs. keskimääräinen elinikä, antaa tarkimmat tulokset, kun R2 on 0,694. Vaikka R2-arvo on sama kuin kuvassa 3B, tämän kuvaajan kaltevuus on lähempänä arvoa 1, mikä osoittaa pienempää siirtymää todellisen ja arvioidun elinajan välillä. Huomaa, että paremmat korrelaatiokertoimet saadaan potenssilakiin perustuvilla regressiokäyrillä, joissa käytetään telomeerien lyhenemisnopeutta ottamatta huomioon telomeerien alkuperäistä pituutta (Kuva 2 E-H).
Lajien elinajan ennusteet telomeeriparametrien avulla II. (A) Arvioitu elinikä, jos telomeerit lyhenisivät 50 %:iin alkuperäisestä pituudesta vs. maksimaalinen elinikä. (B) Arvioitu elinikä, jos telomeerit lyhenisivät 50 prosenttiin alkuperäisestä pituudesta vs. keskimääräinen elinikä. (C) Arvioitu elinikä, jos telomeerit lyhenisivät 75 %:iin alkuperäisestä pituudesta vs. suurin elinikä. (D) Arvioitu elinikä, jos telomeerit lyhenisivät 75 prosenttiin alkuperäisestä pituudesta vs. keskimääräinen elinikä. Arvioitu elinikä lasketaan seuraavan yhtälön avulla: (”Telomeerien alkuperäinen pituus” – ”Telomeerien alkuperäinen pituus” × ”prosenttiosuus alkuperäisestä pituudesta”)/”Telomeerien lyhenemisnopeus”.” (E) Graafinen havainnollistus, joka osoittaa tämän artikkelin tärkeimmän havainnon eli sen, että nopeampi telomeerien lyhenemisnopeus johtaa lyhyempään lajin elinikään.
Toinen ominaisuus, joka korreloi eliniän kanssa, on ruumiinpaino (26). Yleensä suuremmilla lajeilla, kuten norsuilla ja valailla, on pidempi elinikä kuin pienillä lajeilla, kuten hiirillä ja kaneilla. Eräässä tutkimuksessa verrattiin 1 456 eri lajin massaa ja elinikää, ja siinä havaittiin suuntaus, jonka mukaan elinikä pitenee suuremman massan myötä (R2 = 0,397) (26). Aineistomme lajeilla havaitsimme myös korrelaation massan ja elinajan välillä (SI-liite, taulukko S3). Lajin telomeerien lyhenemisnopeus korreloi myös ruumiinpainon kanssa, kun R2 oli 0,413 (SI-liite, kuva S1). Lajeilla, joilla on suurempi ruumiinpaino, on yleensä alhaisempi telomeerien lyhenemisnopeus ja pidempi elinikä.
Jotkut kirjoittajat ovat osoittaneet käänteistä korrelaatiota elinajan ja sykkeen, eli organismin aineenvaihduntaan liittyvän muuttujan, välillä (27, 28), vaikka laajemmat tutkimukset eivät näytä tukevan tätä käsitystä (29). Tässä asetumme käsittelemään mahdollista korrelaatiota sykkeen ja telomeerien pituuden välillä. Ensinnäkin havaitsimme korrelaation elinajan ja sykkeen välillä aineistossamme (SI-liite, taulukko S3). Havaitsimme myös lineaarisen korrelaation telomeerin lyhenemisnopeuden ja sykkeen välillä, jonka R2 oli 0,974 (SI-liite, kuva S2 A ja B).
Selvittääksemme seuraavaksi useiden muuttujien vaikutusta elinajan pituuteen, kun ne yhdistetään samaan malliin, suoritimme monimuuttujaisen lineaarisen regression. Syöttömuuttujat telomeerien lyhenemisnopeus, telomeerien alkupituus, kehon massa ja syke sovitettiin joko keskimääräiseen elinikään tai maksimaaliseen elinikään. Regressiossa käytetyt tiedot esitetään SI-liitteen taulukossa S4. Kaikkien datapisteiden log-arvoa käytettiin regressiossa alkuperäisten arvojen sijasta. Kunkin muuttujan ja keskimääräisen eliniän tai maksimaalisen eliniän välinen lineaarinen R2-korrelaatiokerroin oli joko korkeampi, kun käytettiin log-muunnettuja tietoja, tai korrelaatiokertoimessa ei ollut havaittavaa muutosta alkuperäisen telomeerin pituusmuuttujan tapauksessa. Keskimääräiseen elinikään sovitetun mallin R2-arvoksi saatiin 0,997 ja mukautetuksi R2-arvoksi 0,992 (SI-liite, taulukko S5), mikä osoittaa, että nämä muuttujat voivat ennustaa keskimääräistä elinikää. P-arvot (lueteltu sarakkeessa Pr(>|t|)) olivat tilastollisesti merkitseviä kaikkien muuttujien osalta. Telomeerien lyhenemisnopeus oli tilastollisesti merkitsevin muuttuja (P = 0,000422). Malli, joka sovitettiin maksimaaliseen elinikään, antoi R2-arvon 0,950 ja oikaistun R2-arvon 0,884 (SI-liite, taulukko S6), mikä osoittaa, että muuttujat voivat ennustaa myös maksimaalista elinikää. Tässä tapauksessa vain telomeerien lyhenemisnopeutta kuvaava muuttuja oli tilastollisesti merkitsevä (P = 0,0218). Löysimme jälleen käänteisen yhteyden keskimääräisen eliniän ja alkuperäisen telomeerin pituuden välillä, jonka P-arvo oli P = 0,0302. Lyhytikäisillä lajeilla oli alussa pidemmät telomeerit (SI-liite, taulukko S5). Myöskään monimuuttuja-analyysissä alkutelomeerin pituuden ja maksimielinaikojen välinen suhde ei ollut merkitsevä, mikä on sopusoinnussa sen kanssa, että alkutelomeerin pituuden ja maksimielinaikojen välinen käänteinen korrelaatio oli heikompi kuin keskimääräisen eliniän pituuden välillä (kuvat 2 A ja C). Näin ollen nämä tulokset vahvistavat, että telomeerien lyhenemisnopeus (negatiivinen korrelaatio), telomeerien alkupituus (negatiivinen korrelaatio), ruumiinpaino (positiivinen korrelaatio) ja syketaajuus (negatiivinen korrelaatio) voivat ennustaa lajien elinikää ja että näistä muuttujista telomeerien lyhenemisnopeus on se muuttuja, jolla on suurin voima ennustaa elinikää.
Loppujen lopuksi yksi varoitus eri-ikäisillä eläimillä tehdyissä tutkimuksissa on se, että voi esiintyä vaikutus, jossa vanhat eläimet, joilla on lyhyet telomeerit, katoavat valikoivasti kuoleman vuoksi, eikä näitä telomeerejä näin ollen mitata vanhemmalla iällä. Näin ollen telomeerien pituus voi olla keinotekoisen suuri vanhemmissa ikäluokissa, koska vain ne eläimet, joilla on pidemmät telomeerit, pysyvät hengissä näissä ikäluokissa. Se, että telomeerien lyheneminen iän myötä sopii kuitenkin lineaariseen regressioon suurimmalla osalla tutkituista lajeista, osoitti, että tämä ilmiö ei ole kovin vääristävä nykyisessä tutkimuksessamme. Lisäksi tällaisten eläinten katoamisen voisi olettaa tapahtuvan vain hyvin myöhäisessä iässä, eikä suurin osa tämän tutkimuksen eläimistä ollut äärimmäisen vanhoja (Menetelmät).
Johtopäätökset
Vaikka useissa aiemmissa tutkimuksissa on mitattu telomeerien pituutta eri lajeilla (30⇓⇓⇓⇓-35), vain harvat niistä määrittivät telomeerien lyhenemisnopeuksia (4, 6⇓⇓⇓⇓-10, 15, 16). Tältä osin joissakin tutkimuksissa havaittiin korrelaatio telomeerien lyhenemisnopeuden ja lajien elinajan välillä, mukaan lukien ryhmämme aiemmat työt hiirillä ja ihmisillä (1, 4, 6⇓⇓⇓⇓-10); näissä tutkimuksissa ei kuitenkaan vertailtu vierekkäin telomeerien lyhenemisnopeutta fylogeneettisesti kaukana toisistaan olevilla lajeilla käyttämällä yhtä ainoaa tekniikkaa telomeerien mittaamiseen.
Tässä tutkimuksessamme telomeerien pituudet ja telomeerien lyhenemisnopeus useilta hyvin erilaisilta lajeilta, joiden elinikä on hyvin erilainen, mukaan lukien linnut ja nisäkkäät, saatiin samassa laboratoriossa käyttäen herkkää HT Q-FISH -tekniikkaa, jonka avulla voidaan määrittää telomeerien absoluuttiset pituusarvot emäspariyksikköinä sekä yksittäiset telomeerisignaalit. Tämän tutkimuksen rajoituksena on kuitenkin se, että joistakin lajeista on käytettävissä vain vähän yksilöitä.
Tässä esitetyt tulokset osoittavat, että lajin telomeerien lyhenemisnopeutta voidaan käyttää ennustamaan kyseisen lajin elinikää ainakin tämänhetkisellä aineistolla (kuva 3E). Havaitsimme, että keskimääräinen telomeerien pituus syntymähetkellä ei korreloi lajin elinajan kanssa, koska monilla lyhytikäisillä lajeilla oli hyvin pitkät telomeerit ja pitkäikäisillä lajeilla hyvin lyhyet telomeerit. Tulevissa tutkimuksissa on perusteltua määrittää telomeerien lyhenemisnopeus lajeilla, kuten alastomilla rotilla tai lepakolla, jotka eivät vastaa hyvin ruumiinkoon mukaan ennustettua elinikää (26, 36).
Loppujen lopuksi se, että telomeerien lyhenemisnopeutta voidaan käyttää ennustamaan elinikää, viittaa siihen, että lyhyiden telomeerien aiheuttamat soluvaikutukset, kuten solujen vanheneminen, voivat olla kriittinen lajin elinikää määrittävä tekijä. Jotkut tutkimukset korreloivat DNA:n korjauskyvyn ja lajien pitkäikäisyyden välillä (37⇓-39). Erityisesti kyky korjata UV-säteilyn aiheuttamia vaurioita korreloi positiivisesti elinajan kanssa eri lajeilla, myös kädellisillä (37, 38). Myös DNA:n korjausasteet ovat korkeammat pidempään elävillä jyrsijälajeilla verrattuna jyrsijälajeihin, joiden elinikä on lyhyempi (39). On mielenkiintoista huomata, että lyhyet telomeerit indusoivat DNA-vaurioita, ja puolestaan tietyntyyppiset DNA-vauriot, kuten UV-säteilytys tai oksidatiivinen stressi, voivat myös johtaa telomeerien lyhenemiseen (40⇓-42).
Menetelmät
Hiiret.
Hiirikanta oli >95 % C57BL/6-taustainen. Kaikki hiiret tuotettiin ja säilytettiin Madridissa, Espanjassa sijaitsevan Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO) -laitoksen spesifisistä patogeeneistä vapaassa esteessä. Vieroituksen jälkeen 5 hiirtä sijoitettiin häkkiä kohti ja ruokittiin ad libitum puhdistamattomalla steriloitavalla Teklad 2018 18 % proteiinipitoisella jyrsijöiden ruokavaliolla (Harlan; TD.2018S). Kaikki eläinkokeet hyväksyttiin CNIO-Instituto de Salud Carlos III:n tutkimuksen ja eläinten hyvinvoinnin eettisessä komiteassa, ja ne suoritettiin Euroopan koe-eläintieteellisten yhdistysten liiton suositusten mukaisesti.
Verinäytteet.
Verinäytteet saatiin Madridin eläintarhasta lukuun ottamatta hiirinäytteitä, jotka saatiin CNIO:n eläintilasta, ja Audouinin lokkeja. Kustakin yksilöstä mitattiin vain yksi aikapiste, joten kyseessä on poikkileikkaustutkimus. Hiiristä (Mus musculus) otettiin verinäytteet seitsemältä yksilöltä, joiden ikä vaihteli 1,4 ja 2,6 vuoden välillä. Delfiineistä (Tursiops truncatus) otettiin verinäytteet yhdeksältä yksilöltä, joiden ikä vaihteli 8,6 ja 50,1 vuoden välillä. Vuohien (Capra hircus) verinäytteet otettiin 15 yksilöltä, joiden ikä vaihteli 0,85 ja 10,1 vuoden välillä. Porojen (Rangifer tarandus) verinäytteet otettiin 8 yksilöltä, joiden ikä vaihteli 1,44 ja 10,5 vuoden välillä. Amerikkalaisista flamingoista (Phoenicopterus ruber) otettiin verinäytteet 17 yksilöltä, joiden ikä vaihteli välillä 0,79-38,8 v. Kiuruvasikan (Gyps fulvus) verinäytteet otettiin 6 yksilöltä, joiden ikä vaihteli välillä 8,06-21 vuotta.4 v. Sumatran elefanttilajin (Elephas maximus sumatranus) verinäytteet otettiin neljältä yksilöltä, joiden ikähaarukka vaihteli välillä 6,14-24,7 v. Audouinin lokit otettiin näytteiksi Ebro-joen suistossa (Koillis-Espanjassa) sijaitsevasta pesivästä siirtokunnasta. Tämän Audouinin lokin lajin verinäytteet otettiin 21 yksilöltä (joiden ikä vaihteli muutaman kuukauden ja 21,9 vuoden välillä), jotka valittiin iän määrittämisen jälkeen polyvinyylikloridirengasmerkeistä. Verinäytteet käsiteltiin erytrosyyttien lyysipuskurilla (Qiagen; luettelonumero 79217) valmistajan protokollan mukaisesti. Telomeerit mitattiin siis kaikkien lajien osalta leukosyyttisoluista. Tämän jälkeen näytteet pakastettiin hitaasti -80 °C:ssa Nalgene Cryo Freezing Container -säiliössä (Nalgene; luettelonumero 5100-0001).
HT Q-FISH.
HT Q-FISH -prosessi on kuvattu aiemmin (1). Lyhyesti sanottuna pakastetut erytrosyyttien lyysipuskurilla käsitellyt verinäytteet sulatettiin ensin nopeasti ja resuspendoitiin uudelleen täydelliseen RPMI-mediaan. Solut kiinnitettiin kirkaspohjaisten mustaseinäisten 96-kuoppalevyjen (Greiner Bio-One, Inc.; luettelonumero 655087) kuoppiin (30 000-150 000 solua/kuoppa), jotka oli esipäällystetty 0,001-prosenttisella (wt/vol) poly-l-lysiiniliuoksella (Sigma; P8920-100 ml) 30 minuutiksi 37 °C:ssa. Levyn ulkoreunan kuoppia ei käytetty. Soluja inkuboitiin 37 °C:ssa enintään 4 tuntia ennen kiinnittämistä. Solut fiksoitiin lisäämällä 200 μl fiksatiiviliuosta (metanoli/etikkahappo 3:1) hitaasti soluihin kemikaalihuoneessa ja inkuboimalla 10-15 minuuttia. Liuos poistettiin, ja tämä toistettiin vielä 3 kertaa. Tämän jälkeen levy fiksoitiin yön yli -20 °C:ssa fiksatiiviliuoksen ollessa kuopissa.
Fiksatiiviliuos poistettiin ja levy kuivattiin kuumalevyllä 37 °C:ssa 1 h kemikaalihuuvassa. Kuopat kuivattiin uudelleen 200 μl:lla PBS:ää. Solut kiinnitettiin 200 μL:lla 4 % formaldehydiä PBS:ssä 2 min ajan huoneenlämmössä (RT). Levy pestiin 3 × 5 min PBS:llä. Soluseinät hajotettiin esilämmitetyllä pepsiiniliuoksella (100 ml H2O:ta, 100 μl 37-prosenttista HCl:a ja 100 mg pepsiiniä ) 15 minuutin ajan 37 °C:ssa. Levy pestiin 2 × 5 minuuttia 200 μl:lla PBS:ää, minkä jälkeen se dehydratoitiin 5 minuutin sarjoilla 70 %, 90 % ja 100 % etanolipesuja. Levy kuivattiin 1 h 37 °C:ssa tai yön yli RT:ssä.
Seuraavaksi levylle lisättiin 50 μL Tel-Cy3 PNA -luotainta sisältävää hybridisointiliuosta (95 μL 1 M Tris, pH 7,0, 812 μL MgCl2-liuosta , 6,65 ml deionisoitua formamidia, 475 μL estoreagenssireagenssia , 1,28 ml H2O:ta ja 190 μL Tel-Cy3 PNA -luotainta ). DNA denaturoitiin lämmittämällä levyä kuumalevyllä 85 °C:ssa 5 minuutin ajan. Sen jälkeen levyä inkuboitiin 2 tuntia RT:ssä pimeässä, pestiin levyn ravistimella 15 minuutin ajan liuoksella, joka sisälsi 1 mL 1 M Tris, pH 7, 1 mL 10 % BSA:ta, 28 mL H2O:ta ja 70 mL formamidia, ja pestiin sitten levyn ravistimella 2 × 5 minuutin ajan TBST:llä (TBS, jossa on 0,08-prosenttista 0,08-prosenttista Tween 20:tä). Seuraavaksi levy pestiin 1 × 5 minuuttia levyn ravistimella TBST:llä, joka sisälsi 1 μg/ml DAPI:tä (4′,6-diamidino-2-fenyylindoli, dihydrokloridi; Life Technologies; luettelonumero: 1 μg/ml). D-1306) tuman värjäämiseksi. Sitten levy pestiin 1 × 5 min PBS ja 50 μL Mowiol-liuosta (10 g Mowiol , 25 ml 85 % glyserolia, 25 ml H2O, 12 ml 0,2 M Tris HCl, pH 8,5, ja 2,5 % DABCO-biklooktaania; Sigma-Aldrich; luettelon nro. D27802-25G]) lisättiin. Levyt suljettiin alumiinifoliokansilla (Beckman Coulter; luettelonumero 538619) ja säilytettiin 4 °C:ssa pimeässä. Levyt käsiteltiin sitten HT-mikroskopialla, kuten kohdassa HT-mikroskopia on kuvattu, 48 tunnin kuluessa.
HT-mikroskopia.
Kuvat otettiin Opera High Content Screening System -järjestelmällä (PerkinElmer), joka oli varustettu UV-lampulla, 561 nm:n laserilla ja 40 ×/0,9 N.A. vesi-immersio-objektiivilla. Kuvat analysoitiin Acapella Image -analyysiohjelmistolla (PerkinElmer). Tiedot analysoitiin Microsoft Excel -ohjelmalla (Microsoft). Telomeerien fluoresenssiarvot muunnettiin kilobaseiksi ulkoisella kalibroinnilla CCRF-CEM (7,5 kb), L5178Y-S (10,2 kb) ja L5178Y-R (79,7 kb) solulinjoilla (43, 44).
Erittäin iäkkäiden yksilöiden määrä eri lajeissa
Määrittelimme erittäin iäkkääksi iän, joka ylitti 70 %:n arvon kullakin lajin maksimaalisesta elinajasta. Ihmisen kohdalla tämä vastaisi ikää 122,5 × 0,7 = 73,5 vuotta. Tutkimuksessamme näytteeksi otettujen vanhojen yksilöiden (ikä yli 70 % enimmäiseliniän pituudesta) määrä on kunkin lajin osalta seuraava: 0/7 (0 %) hiirille, 3/8 (37,5 %) delfiinille, 0/15 (0 %) vuohelle, 0/8 (0 %) porolle, 0/16 (0 %) amerikanflamingolle, 0/6 (0 %) korppikotkalle, 3/21 (14 %).3 %) Audouinin lokin osalta ja 0/4 (0 %) Sumatran norsun osalta.
Tietojen analysointi.
Kaaviot luotiin ja tietojen analysointi suoritettiin Microsoft Excelissä. Monimuuttujainen lineaarinen regressio suoritettiin R-tilasto-ohjelmistolla (45).
Kiitokset
Kiitämme Madridin eläintarhaa kaikesta avusta ja verinäytteiden toimittamisesta eri lajeista. Kiitämme myös Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO) (tai ”Espanjan kansallinen syöpätutkimuskeskus” Madridissa, Espanjassa) konfokaalimikroskooppiydintä ja eläinlaitosta, erityisesti Rosa Serranoa, kaikesta avusta ja avusta sekä CNIO:n bioinformatiikkaosastoa, erityisesti Kevin Troulé Lozanoa, avusta analyysissä. Kiitämme Ebro Delta Natural Parkin henkilökuntaa ja M. García-Tarrasónia näytteenotosta ja tiloista kenttätyön aikana. Kiitämme myös tohtori Dani Oroa (Centre d’Estudis Avançats de Blanes-Consejo Superior de Investigaciones Científicas) avusta rengastettujen Audouinin lokkien iän määrittämisessä. Osittainen rahoitus saatiin hankkeesta CGL2016-80963-R (Ministerio Economía, Industria y Competividad). Kiitämme myös Paula Martinezia avusta käsikirjoituksen tarkistamisessa. M.A.B.:n laboratorion tutkimusta rahoittavat Espanjan talous- ja kilpailukykyministeriön hankkeet (SAF2013-45111-R ja SAF2015-72455-EXP), Comunidad de Madridin hanke (S2017/BMD-3770), World Cancer Research Project (16-1177) ja Fundación Botín (Espanja).
Footnotes
- ↵1Jolle kirjeenvaihto voidaan osoittaa. Sähköposti: mblasco{at}cnio.es.
-
Author contributions: K.W. ja M.A.B. suunnittelivat tutkimuksen; K.W., E.V., E.M.-N. ja C.S. suorittivat tutkimuksen; E.M.-N. ja C.S. osallistuivat uusiin reagensseihin/analyyttisiin välineisiin; E.V. analysoi aineiston; ja K.W. ja M.A.B. kirjoittivat artikkelin.
-
Esintressiyhteysilmoitus: M.A.B. on perustaja ja omistaa Life Length SL:n osakkeita, bioteknologiayrityksen, joka kaupallistaa telomeerin pituuden mittauksia biolääketieteelliseen käyttöön.
-
Tämä artikkeli on PNAS Direct Submission.
-
Tämä artikkeli sisältää tukevaa tietoa verkossa osoitteessa www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1902452116/-/DCSupplemental.