Biofyysikko Adam Cohen kuljeskeli San Franciscossa Kaliforniassa vuonna 2010, kun puhelu yllätti hänet. ”Meillä on signaali”, soittaja sanoi. Lähes 5 000 kilometrin päässä, Cambridgessa, Massachusettsissa, hänen työtoverinsa olivat löytäneet kultaa. Kuukausia kestäneiden epäonnistuneiden kokeiden jälkeen tutkijat olivat löytäneet fluoresoivan proteiinin, jonka avulla he pystyivät seuraamaan signaalien kulkua neuronien välillä.
Mutta jotakin outoa oli tekeillä. Kun Cohen palasi laboratorioonsa Harvardin yliopistoon, hän sai tietää, että kaikki kokeen tallenteet osoittivat outoa kehitystä. Aluksi proteiinilla koristellut neuronit välkkyivät nätisti, kun sähköimpulssit viuhuivat niiden läpi. Mutta sitten solut muuttuivat kirkkaiksi läiskiksi. ”Kunkin nauhoituksen puolivälissä signaali muuttui hurjaksi”, Cohen kertoo.
Niinpä hän päätti liittyä ryhmäänsä kokeen aikana. ”Kun he aloittivat nauhoituksen, he istuivat siinä henkeään pidätellen”, Cohen sanoo. Mutta heti kun he huomasivat, että se toimi, he juhlivat, ”tanssivat ja juoksivat ympäri huonetta”.
Riemuissaan he antoivat pöytälampun valon loistaa suoraan mikroskooppiin. ”Me itse asiassa nauhoitimme innostustamme”, kertoo Daniel Hochbaum, joka oli tuolloin jatko-opiskelijana Cohenin ryhmässä. He hillitsivät juhlintaansa, ja vuotta myöhemmin ryhmä julkaisi tutkimuksensa1 – yhden ensimmäisistä, joka osoitti, että tiettyihin nisäkkäiden neuroneihin suunniteltua fluoresoivaa proteiinia voitiin käyttää yksittäisten sähköisten impulssien reaaliaikaiseen seurantaan.
Neurotieteilijät ovat vuosikymmenien ajan yrittäneet tarkkailla nopeita sähköisiä signaaleja, jotka ovat tärkeä osa aivojen kieltä. Vaikka elektrodit, jännitteen mittaamisen työväline, pystyvätkin tallentamaan luotettavasti yksittäisten neuronien toimintaa, niillä on vaikeuksia vangita monien signaaleja, erityisesti pitkien ajanjaksojen ajan. Kahden viime vuosikymmenen aikana tutkijat ovat kuitenkin löytäneet keinon upottaa fluoresoivia, jännitettä ilmaisevia proteiineja suoraan neuronien solukalvoihin. Oikeanlaisella mikroskoopilla he näkevät solujen syttyvän, kun ne keskustelevat keskenään – kuiskaamalla tai huutamalla. Jännitekuvantamisella voidaan myös tallentaa useiden hermosolujen välistä sähköistä keskustelua kerralla ja sitten keskiarvoistaa nämä signaalit suurista aivokudoksen palasista. Tämä auttaa tutkijoita tutkimaan aivojen sähköistä toimintaa eri alueellisissa mittakaavoissa kuuntelemalla paitsi yksittäisten solujen ääniä myös ”väkijoukon pauhua”, Cohen sanoo.
Viimeisen viiden vuoden aikana tutkijat ovat julkaisseet aiheesta noin 1 000 artikkelia, ja suuret rahoitusohjelmat, kuten Yhdysvaltain kansallisten terveysinstituuttien BRAIN-aloite, ovat vauhdittaneet uudentyyppisten geneettisesti muokattujen jännitemittareiden kehittämistä. Parempien varianttien löytämisen toivossa jotkut ryhmät ovat kehittäneet strategioita, joilla miljoonia proteiineja voidaan seuloa haluttujen ominaisuuksien, kuten kirkkauden, perusteella. Eräässä tällaisessa lähestymistavassa on löydetty indikaattori, joka on kaksi kertaa kirkkaampi kuin vain neljä vuotta aiemmin kehitetyt vastaavat anturit2.
Kun nämä proteiinit paranevat ja mikroskoopian kehittyminen helpottaa niiden havaitsemista, tutkijat toivovat voivansa valaista neurotieteen suurinta arvoitusta: sitä, miten aivojen solut työskentelevät yhdessä muuttaakseen sähköisten pulssien järjestelmän ajatuksiksi, teoiksi ja tunteiksi. Tutkijat kamppailevat edelleen saadakseen selville koko toiminnan laajuuden ja keksiäkseen keinoja nähdä hermoja, jotka toimivat nopeasti ja syvällä aivokudoksessa. Mutta jos edistysaskeleet pystyvät ratkaisemaan nämä tekniset haasteet, ”se olisi vallankumouksellista”, sanoo Rafael Yuste, joka tutkii hermopiirien toimintaa Columbian yliopistossa New Yorkissa.
High-speed process
Keskimääräisissä ihmisaivoissa on noin 120 miljardia hermosolua (neuronia), jotka vastaanottavat ja lähettävät jatkuvasti tietoa dendriiteiksi kutsuttujen haarakkeiden kaltaisten ulokkeiden kautta. Dendriitteihin saapuvat kemialliset tai sähköiset signaalit aiheuttavat solukalvon yli pieniä jännitemuutoksia, jotka ohjautuvat solurunkoon. Kun jännitemuutosten summa saavuttaa kynnyspisteen, josta ei ole paluuta, neuroni laukaisee suuren sähköisen piikin eli toimintapotentiaalin. Tämä jännite syöksyy jopa 150 metrin sekuntinopeudella aksoniksi kutsuttua hermosoluhaaraketta pitkin toiseen haarautuvaan lisäkkeeseen. Siellä kemialliset tai sähköiset signaalit välittävät tiedon eteenpäin seuraavalle dendriittisarjalle.
Neuronaaliset signaalit lähenevät, eroavat ja synkronisoituvat tuottaakseen ajatusten, tunteiden, tekojen ja reaktioiden sinfonian, aina kasvojen punastumisesta vauvan hikkaukseen. Tutkijoiden kuunteluvälineet ovat kuitenkin erittäin rajalliset. Ensimmäisen kerran 1940-luvulla kehitetyt hiuksenohuet miniatyyrielektrodit voidaan työntää aivoihin, neuroneja vasten tai niiden sisään, missä ne mittaavat kalvojännitettä tarkasti ja nopeasti. Tällä menetelmällä voidaan kuitenkin tarkkailla vain yhtä tai kourallista neuroneja kerrallaan – ja vain rajoitetun ajan, koska elektrodit vahingoittavat lopulta solua. Se on kuin yrittäisi saada selville orkesterisovituksen ytimen seuraamalla yhtä soittajaa muutaman sekunnin ajan.
Mikroelektrodien niput voivat tallentaa jopa 200 solun sähköistä aktiivisuutta kerralla, mutta koska nämä elektrodit sijoitetaan lähelle neuroneja eikä niiden sisälle, ne pystyvät havaitsemaan vain toimintapotentiaalit, sähköisen aktiivisuuden terävimmät piikit. Ne ovat kuuroja pehmeämmille äänille – pienille sähköisille muutoksille, jotka eivät vie hermosolua toimintapotentiaaliin asti. Nämä kynnyksen alapuoliset jännitemuutokset ovat avainasemassa aivojen toiminnan kannalta, koska ne summautuvat vähitellen ja ratkaisevat, laukeako neuroni vai ei.
Tiedemiehet alkoivat 1960-luvulla leikitellä ajatuksella anturista tai koettimesta, joka fluoresoisi sähköisen signaalin vaikutuksesta. Suosituimmat anturit, joita kutsutaan kalsiumindikaattoreiksi, syttyvät, kun ne sitoutuvat kalsiumiin, joka virtaa hermosoluun sähköisen aktiivisuuden piikin seurauksena. Kalsiumkuvantamisena tunnettu tekniikka tarjoaa kuitenkin vain välitystiedon; se ei rekisteröi suoraan kalvojännitettä. Ja vaikka se näyttää suurten tapahtumien, kuten toimintapotentiaalien, signaalin, se jättää huomiotta aivojen toiminnan kannalta ratkaisevia asioita, kuten kalvojännitteen hienovaraiset vaihtelut tai toimintapotentiaalia estävät sähköiset signaalit. Kuvittele, että sinfoniakonsertin jälkeen kuulet vain suosionosoitukset: on selvää, että orkesteri on esiintynyt, mutta mitä se soitti, sitä voi vain arvailla.
1970-luvulla tutkijat alkoivat kehittää väriaineantureita, jotka havaitsevat kalvojännitteen muutokset suoraan. Ensimmäiset versiot näistä väriaineista jouduttiin maalaamaan aivoihin umpimähkään, joten ne leimasivat kaikki solutyypit, myös ei-neuronaaliset solut, mikä vaikeutti tiettyjen hermosolujen aktiivisuuden jäsentämistä.
Silloin 1990-luvulla tutkijat alkoivat testata indikaattoreita, jotka voitiin geneettisesti muokata näkymään vain kiinnostavissa neuroneissa. Ensimmäinen3 geneettisesti koodattu jänniteindikaattori (GEVI) kehitettiin vuonna 1997; sen jälkeen tutkijat ovat tuottaneet yli kaksi tusinaa anturia4. Osa näistä on valmistettu yhdistämällä jänniteherkkä proteiini fluoresoiviin molekyyleihin (ks. ”Fluoresenssin makuja”). Kun nämä proteiinit havaitsevat jännitteen muutoksen, ne muuttavat 3D-rakennettaan ja muuttavat sen molekyylin fluoresenssia, johon ne on yhdistetty. Muita jänniteindikaattoreita ovat mikrobien rodopsiinien mutatoidut versiot, jotka ovat fluoresoivia molekyylejä, jotka aiheuttavat jännitteen muutoksen plasmakalvolla valon vaikutuksesta. Nämä proteiinit voivat toimia myös päinvastoin, jolloin niiden vaste valolle – ja siten fluoresenssi – muuttuu vastauksena kalvon jännitteen muutokseen.
Kaikki yksityiskohdissa
Tässä vaiheessa GEVI:t ovat osoittautuneet menestyksekkäiksi yksittäisten toimintapotentiaalien seurannassa sekä viljellyissä neuroneissa, jotka on kasvatettu lautasella, että monenlaisten eläinten ehjissä aivoissa hyönteisistä5 hiiriin6. Yksi tekniikan suurimmista lupauksista on, että sen avulla voidaan tallentaa suurten tapahtumien lisäksi myös pieniä, kynnysarvon alapuolella tapahtuvia muutoksia kalvojännitteessä, jotka heijastavat viestejä, joita neuroni vastaanottaa naapurisoluilta, Cohen sanoo. ”Jännitekuvantamisen avulla voidaan nähdä neuronien syötteet in vivo, mitä meillä ei aiemmin ollut mitään keinoa tarkastella”, hän sanoo.
Viime vuonna Cohen ja hänen kollegansa kehittivät uusia GEVI:itä ja parempia mikroskooppitekniikoita, joiden avulla he voivat rekisteröidä tällaisia kynnyksen alapuolisia jännitemuutoksia monista neuroneista kerralla, myös hiiren aivoissa7,8. Ryhmä pystyi myös tallentamaan samojen neuronien sähköistä aktiivisuutta jopa viikkoa myöhemmin. Kun tiedetään tarkalleen, mitkä neuronit tallennetaan, ja niitä voidaan seurata ajan mittaan, tutkijat voivat tarkastella näiden neuronien välisiä johdotuksia, sanoo Ed Boyden, neurotieteilijä Massachusetts Institute of Technologysta Cambridgessa. Näin ”aivojen rakenne voidaan yhdistää niiden toimintaan”, hän sanoo. ”Se on yksi koko neurotieteen ydinkysymyksistä.”
GEVI:n toinen etu on se, että toisin kuin elektrodit, jotka tallentavat pääasiassa solurungosta tulevia signaaleja, ne voivat tallentaa sähköisiä signaaleja mistä tahansa hermosolun osasta, aina dendriittien kärkiin asti (ks. ”Vaa’ankielet”). Tämä on kuin pystyisi kuuntelemaan erityisesti pianistin vasemman käden soittamia nuotteja. ”Olen haaveillut tästä jo pitkään – enkä ole ainoa”, sanoo Katalin Toth, joka on neurobiologi Lavalin yliopistossa Quebec Cityssä Kanadassa. Monet neurotieteilijät pyrkivät hänen mukaansa seuraamaan jännitettä kokonaisten neuronien läpi nähdäkseen, miten se muuttuu solun eri alueilla.
Wei Wei, neurobiologi Chicagon yliopistossa Illinoisin osavaltiossa, selvittää GEVI:n avulla, miten erilaiset sähköiset syötteet integroituvat hiiren verkkokalvon neuroneissa. Wei on kiinnostunut eräästä neuroniluokasta, joka reagoi voimakkaammin visuaaliseen ärsykkeeseen, kun se liikkuu tiettyyn suuntaan. Tarkastelemalla, miten kalvojännite muuttuu näiden neuronien eri osissa, hän toivoo ymmärtävänsä, miten solut summaavat saapuvat signaalit havaitakseen liikkeen suunnan.
Pariisin Ecole Normale Supérieure -ylioppilaitoksessa työskentelevä neurofysiologian tohtori Vincent Villette suunnittelee käyttävänsä jännitemittareita tutkiakseen, miten sähköisten signaalien säännönmukaiset kynnyksen alapuolisten signaalien vaihtelut määrittelevät sen, miten hiiren pikkuaivojen neuroneiden hermosoluilla on tapana koordinoida lihasten toimintaa. ”On paljon ymmärrettävää siinä, miten solut toimivat yhdessä”, Villette sanoo.
Kalvojännitteen visuaalisen lukemisen avulla tutkijat voivat myös nähdä sähköisiä signaaleja, jotka pikemminkin estävät kuin laukaisevat hermosolujen laukeamisen. Koska estäviä signaaleja on mahdotonta tallentaa kalsiumkuvantamisen kaltaisilla menetelmillä, on epäselvää, miten ne tarkalleen ottaen muokkaavat aivotoimintaa, sanoo Rosa Cossart, neurobiologi Välimeren neurobiologian instituutista Marseillessa, Ranskassa.
Cossart on käyttänyt elektrodeja ja kalsiumkuvantamista jo vuosia, mutta hän on nyt innokas kokeilemaan GEVI:tä. Hän toivoo, että näiden antureiden avulla hän voi mitata jännitettä suurella nopeudella useista neuroneista – vähintään 50:stä – samanaikaisesti elävässä hiiressä. Tämä auttaisi ymmärtämään, miten neuroniryhmät integroivat sähköisiä signaaleja – sekä kiihottavia että estäviä – tukeakseen toimintoja, jotka ovat ratkaisevia aivojen kehitykselle ja toiminnalle, hän sanoo.
Syviä haasteita
Korkeista odotuksista huolimatta GEVI:iden saaminen toimimaan laboratoriossa voi olla hankalaa. Otetaan esimerkiksi Helen Yang: jatko-opiskelijana kalifornialaisessa Stanfordin yliopistossa hän päätti kokeilla GEVI:tä keinona tutkia hermosoluja hedelmäkärpäsen näköjärjestelmässä. Ensimmäisen kokeensa aikana Yang ei kuitenkaan nähnyt mitään muutosta solujen fluoresenssissa, ei edes silloin, kun hän väläytti kirkasta valoa kärpästen silmiin. Vasta kun hän analysoi tietoja, hän tajusi, että visuaaliset ärsykkeet tuottivat signaalin, mutta se oli vain pieni. ”Olin aika innoissani, mutta laboratoriotoverini eivät niinkään”, hän sanoo. ”Vasteet olivat melko pieniä ja meluisia.”
Yang alkoi leikkiä mikroskoopin asetuksilla, lisäsi laserin tehoa ja nopeutti kuvantamista. ”Käytännössä sain sen toimimaan niin nopeasti kuin mikroskooppimme pystyi”, hän sanoo. Tämä johtui siitä, että indikaattorin vaste sähköiseen signaaliin oli niin nopea, että fluoresenssin muutos oli havaittavissa vain sekunnin murto-osan ajan. ”Jos otat vain yhden kuvan sinä aikana, kun solu reagoi, vaste ei näytä lainkaan suurelta”, Yang sanoo.
Yang onnistui lopulta käyttämään GEVI:itä tutkiakseen, miten kärpästen neuronit käsittelevät visuaalisia vihjeitä5, mutta hänen kohtaamansa haasteet ovat toistaiseksi estäneet jännitekuvantamisen yleistymisen. Se vaatii kehittyneitä, usein räätälöityjä mikroskooppialustoja, Cohen sanoo. ”Tätä ei voi tehdä vain isoäitisi fluoresenssimikroskoopilla.”
Viiden viime vuoden aikana BRAIN-aloitteen taloudellinen tuki on vauhdittanut alan edistystä, mukaan lukien parempien GEVI:iden kehittäminen, sanoo Michael Lin, Stanfordin proteiini-insinööri.
Uusien antureiden kehittämisen rinnalla tutkijat työskentelevät tekniikoiden parissa, joilla voidaan kuvata tarkasti aivojen läpi kulkevia nopeita sähköisiä signaaleja. Yksi haaste on se, että useimmat saatavilla olevista tekniikoista toimivat hyvin vain maljassa tai aivojen pinnalla olevilla soluilla. Nisäkkäiden aivot eivät kuitenkaan ole läpinäkyvät: itse asiassa ne näyttävät tofulta, sanoo Kalifornian yliopistossa Berkeleyssä työskentelevä fyysikko Na Ji.
Syvemmälle kurkistellakseen tutkijoiden on turvauduttava invasiivisempiin menetelmiin, kuten poistamalla osa pintakudoksesta tai työntämällä pieniä optisia laitteita, niin sanottuja mikroendoskooppeja, suoraan aivoihin. Vaihtoehtoinen, ei-invasiivinen tapa kurkistaa läpinäkymättömiin kudoksiin – jopa 1 millimetrin syvyyteen – on kaksifotonimikroskopia. Tässä tekniikassa käytetään pidemmän aallonpituuden ja matalamman energian valoa, joka voi tunkeutua syvemmälle kudoksiin. Koska kaksifotonimikroskoopit valaisevat ja tallentavat vain yhdestä pisteestä kerrallaan, ne ottavat kuvia liian hitaasti, jotta aivojen nopeaa toimintaa voitaisiin seurata. Asiantuntijat luottavat kuitenkin siihen, että tekniikan kehittyminen mahdollistaa pian GEVI:iden tuottamien signaalien näkemisen nopeammin. ”Se on ehdottomasti toteutettavissa”, Ji sanoo.
Jos eri lähestymistavat pystyvät voittamaan nämä haasteet, tutkijoilla ei ole epäilystäkään siitä, etteikö jännitekuvantamisesta tulisi vakiomenetelmä aivotoiminnan mittaamisessa. ”Seuraavan vuoden tai kahden aikana näemme paljon artikkeleita, joissa on sovellettu jänniteantureita ja opittu biologiaa”, sanoo Thomas Clandinin, Stanfordin neurobiologi. Jotkut sanovat, että tekniikka voisi jopa korvata elektrodit kysymyksissä, jotka liittyvät siihen, miten neuronit käsittelevät ja yhdistävät tietoa.
Erikoistutkijat ovat erityisen toiveikkaita: Hochbaum, joka on nyt post doc -tutkijana Harvardin lääketieteellisessä tiedekunnassa Bostonissa, sanoo, että pitkällä tähtäimellä GEVI:stä tulee go-to-työkalu, jolla tutkitaan, miten solun eri osastot reagoivat kynnystä alemman kynnyksen signaaleihin. Hän aikoo käyttää jännitekuvausta ymmärtääkseen, miten tällaiset signaalit muuttavat neuronien välisiä yhteyksiä, mikä on keskeinen prosessi oppimisessa. Mahdollisuudet ovat jännittäviä, Hochbaum sanoo, mutta hän on oppinut ainakin yhden tärkeän läksyn niistä ensimmäisistä päivistä, jolloin hän hyppeli ympäri laboratoriota riemuissaan nähtyään hehkun mikroskoopissa: kun kokeet toimivat, pidä juhlat minimissä.