Keskeiset entsyymit ja komponentitEdit
V(D)J-rekombinaatioprosessia välittää VDJ-rekombinaasi, joka on monipuolinen joukko entsyymejä. Keskeisiä entsyymejä ovat rekombinaatiota aktivoivat geenit 1 ja 2 (RAG), terminaalinen deoksinukleotidyylitransferaasi (TdT) ja Artemis-nukleaasi, joka on osa ubiikkia DNA:n korjaamiseen käytettävää NHEJ-reittiä (non-homologous end joining). Useiden muiden entsyymien tiedetään osallistuvan prosessiin, ja niihin kuuluvat DNA-riippuvainen proteiinikinaasi (DNA-PK), XRCC4-proteiini 4 (XRCC4), DNA-ligaasi IV, NHEJ1 (NHEJ1; tunnetaan myös nimellä Cernunnos tai XRCC4:n kaltainen tekijä ), hiljattain löydetty XRCC4:n ja XRCC4:n ja XLF:n paralogi (PAXX) sekä DNA-polymeraasit λ ja μ. Tämän lisäksi DNA-polymeraasit ovat myös osa DNA:n DNA:n korjaamiseen osallistuvia entsyymejä. Jotkin mukana olevista entsyymeistä ovat spesifisiä lymfosyyteille (esim. RAG, TdT), kun taas toisia esiintyy muissa solutyypeissä ja jopa ubiikkisesti (esim. NHEJ-komponentit).
Rekombinaation spesifisyyden ylläpitämiseksi V(D)J-rekombinaasi tunnistaa ja sitoutuu rekombinaation signaalisekvensseihin (RSS), jotka reunustavat muuttuvan (V), monimuotoisen (D) ja yhdistävän (J) geenin segmenttejä. RSS:t koostuvat kolmesta elementistä: seitsemästä konservoidusta nukleotidista koostuvasta heptameerista, 12 tai 23 baseparin pituisesta spacer-alueesta ja yhdeksästä konservoidusta nukleotidista koostuvasta nonameerista. Vaikka suurin osa RSS:istä vaihtelee sekvenssiltään, heptameerin konsensussekvenssi on CACAGTG ja nonameerin konsensussekvenssi ACAAAAACC; ja vaikka spacer-alueen sekvenssi on heikosti konservoitunut, sen pituus on hyvin konservoitunut. Spacer-alueen pituus vastaa noin yhtä (12 baseparia) tai kahta (23 baseparia) DNA-kierrosta. Niin sanotun 12/23-säännön mukaisesti yhdistettävät geenisegmentit ovat yleensä vierekkäin eripituisten RSS-alueiden kanssa (eli toisessa on ”12RSS” ja toisessa ”23RSS”). Tämä on tärkeä piirre V(D)J-rekombinaation säätelyssä.
ProcessEdit
V(D)J-rekombinaatio alkaa, kun V(D)J-rekombinaasi (RAG1:n aktiivisuuden kautta) sitoutuu koodaavaa geenisegmenttiä (V, D tai J) reunustavaan RSS:ään ja luo DNA:han yksisäikeisen nikin RSS:n ensimmäisen emäksen (juuri ennen heptameeria) ja koodaavan segmentin väliin. Tämä on pohjimmiltaan energeettisesti neutraalia (ATP:n hydrolyysiä ei tarvita) ja johtaa vapaan 3′-hydroksyyliryhmän ja 5′-fosfaattiryhmän muodostumiseen samaan säikeeseen. Rekombinaasi sijoittaa reaktiivisen hydroksyyliryhmän hyökkäämään vastakkaisen säikeen fosfodiesterisidoksen kimppuun, jolloin muodostuu kaksi DNA:n päätä: hiusneula (stem-loop) koodaavaan segmenttiin ja tylppä pää signaalisegmenttiin. Nykyisen mallin mukaan DNA:n nikkarointi ja hiusneulan muodostuminen tapahtuu molemmilla säikeillä samanaikaisesti (tai lähes samanaikaisesti) kompleksissa, jota kutsutaan rekombinaatiokeskukseksi.
Tylpät signaalipäät ligatoituvat toisiinsa muodostaen ympyränmuotoisen DNA:n kappaleen, joka sisältää kaikki koodaavien segmenttien väliset sekvenssit ja jota kutsutaan signaaliliitokseksi (vaikkakin luonteeltaan ympyränmuotoinen, tämä ei ole sekoitettava plasmidiin). Vaikka alun perin ajateltiin, että signaaliliitokset häviävät peräkkäisten solunjakautumien aikana, on näyttöä siitä, että signaaliliitokset voivat palata genomiin ja johtaa patologioihin aktivoimalla onkogeenejä tai keskeyttämällä kasvainsuppressorigeenin (-geenien) toiminnan (-toiminnot).
Koodaavia päitä prosessoidaan edelleen ennen niiden ligaatiota useilla tapahtumilla, jotka johtavat viime kädessä liitosten monimuotoisuuteen. Prosessointi alkaa, kun DNA-PK sitoutuu kuhunkin katkenneeseen DNA-päähän ja rekrytoi useita muita proteiineja, kuten Artemis, XRCC4, DNA-ligaasi IV, Cernunnos ja useita DNA-polymeraaseja. DNA-PK muodostaa kompleksin, joka johtaa sen autofosforylaatioon, jolloin Artemis aktivoituu. Artemiksen aktiivisuus avaa koodaavan pään hiuspinnit. Jos ne avataan keskeltä, tuloksena on tylppä DNA:n pää; monissa tapauksissa avautuminen on kuitenkin ”epäkeskeistä” ja johtaa siihen, että toiseen säikeeseen jää ylimääräisiä emäksiä (overhang). Näitä nukleotideja kutsutaan palindromisiksi (P) nukleotideiksi, koska DNA:n korjausentsyymien purkaessa ylikorkeutta syntyy palindrominen sekvenssi. Artemiksen suorittama hiusneulan avautumisprosessi on ratkaiseva vaihe V(D)J-rekombinaatiossa, ja se on puutteellinen vaikean yhdistetyn immuunipuutoksen (scid) hiirimallissa.
Seuraavaksi XRCC4, Cernunnos ja DNA-PK kohdistavat DNA:n päät toisiinsa ja rekrytoivat terminaalisen deoksinukleotidyylitransferaasin (TdT), mallineesta riippumattoman DNA-polymeraasin, joka lisää koodaavaan päähän muita kuin templatoituja (N) nukleotideja. Lisäys on enimmäkseen satunnaista, mutta TdT suosii G/C-nukleotideja. Kuten kaikki tunnetut DNA-polymeraasit, TdT lisää nukleotideja yhteen säikeeseen 5′-3′-suunnassa.
Viimeiseksi eksonukleaasit voivat poistaa emäksiä koodaavista päistä (mukaan lukien kaikki mahdollisesti muodostuneet P- tai N-nukleotidit). DNA-polymeraasit λ ja μ lisäävät sitten tarpeen mukaan lisänukleotideja, jotta molemmat päät olisivat yhteensopivia yhdistämistä varten. Tämä on stokastinen prosessi, joten P- ja N-nukleotidien lisäys ja eksonukleolyyttinen poisto voi tapahtua missä tahansa yhdistelmässä (tai ei lainkaan). Lopuksi prosessoidut koodaavat päät ligmatoidaan toisiinsa DNA-ligaasi IV:n avulla.
Kaikki nämä prosessointitapahtumat johtavat paratopiin, joka on hyvin vaihteleva, vaikka samoja geenisegmenttejä yhdistettäisiin uudelleen. V(D)J-rekombinaatio mahdollistaa immunoglobuliinien ja T-solureseptorien syntymisen antigeeneille, joita organismin tai sen esi-isän (esi-isien) ei tarvitse olla aiemmin kohdannut, mikä mahdollistaa adaptiivisen immuunivasteen kehittyville uusille tai usein muuttuville patogeeneille (esim. kausi-influenssa). Tärkeä varoitus tässä prosessissa on kuitenkin se, että DNA-sekvenssin on pysyttävä kehyksessä, jotta lopullinen proteiinituote säilyttää oikean aminohapposekvenssin. Jos syntyvä sekvenssi on kehyksen ulkopuolella, solun kehitys pysähtyy, eikä solu selviä sukukypsäksi. V(D)J-rekombinaatio on näin ollen hyvin kallis prosessi, jota on säädeltävä ja valvottava (ja valvotaan) tiukasti.