H-D-vaihtoa mittasi alun perin vedynvaihdon isä Kaj Ulrik Linderstrøm-Lang käyttäen tiheysgradienttiputkia. Nykyaikana H-D-vaihtoa on seurattu lähinnä menetelmillä: NMR-spektroskopia, massaspektrometria ja neutronikristallografia. Jokaisella näistä menetelmistä on omat etunsa ja haittansa.
NMR-spektroskopiaEdit
Vety- ja deuterium-ytimet eroavat toisistaan suuresti magneettisilta ominaisuuksiltaan. Näin ollen ne on mahdollista erottaa toisistaan NMR-spektroskopian avulla. Deuteroneja ei havaita 1H NMR-spektrissä ja päinvastoin protoneja ei havaita 2H NMR-spektrissä. Jos voimakkaasti deuteroidun näytteen 1H NMR-spektrissä havaitaan pieniä signaaleja, niitä kutsutaan jäännössignaaleiksi. Niiden avulla voidaan laskea molekyylin deuteroitumisaste. Vastaavia signaaleja ei havaita 2H-NMR-spektreissä, koska tämän tekniikan herkkyys on alhainen verrattuna 1H-analyysiin. Deuteroneilla on tyypillisesti hyvin samanlaiset kemialliset siirtymät kuin niiden analogisilla protoneilla. Analyysi 13C NMR-spektroskopian avulla on myös mahdollista: vedyn (1/2) ja deuteriumin (1) erilaiset spin-arvot johtavat erilaisiin jakautumiskertoimiin. NMR-spektroskopiaa voidaan käyttää molekyylien paikkakohtaisen deuteroitumisen määrittämiseen.
Toinen menetelmä käyttää HSQC-spektrejä. Tyypillisesti HSQC-spektrit tallennetaan sarjana aikapisteitä, kun vety vaihtuu deuteriumin kanssa. Koska HSQC-koe on spesifinen vedylle, signaali häviää eksponentiaalisesti vedyn vaihtuessa. Tällöin dataan voidaan sovittaa eksponenttifunktio ja saada vaihtovakio. Tällä menetelmällä saadaan jäännöskohtaista tietoa kaikista proteiinin jäännöksistä samanaikaisesti Suurin haittapuoli on se, että se edellyttää spektrin määrittämistä etukäteen kyseiselle proteiinille. Tämä voi olla hyvin työlästä ja rajoittaa menetelmän yleensä alle 25 kDa:n proteiineihin. Koska HSQC-spektrin tallentaminen kestää minuuteista tunteihin, nopeasti vaihtuvat amidit on mitattava käyttäen muita pulssisekvenssejä.
MassaspektrometriaMuokkaa
Vety-deuterium-vaihtomassaspektrometrialla voidaan määrittää H/D-vaihdon läpikäyneiden molekyylien yleinen deuteriumpitoisuus. Vaadittavan näytteen valmistuksen vuoksi sen katsotaan yleensä antavan tarkan mittauksen vain ei-vaihdettavista vetyatomeista. Se voi myös sisältää H/D-vaihdon kaasufaasissa tai liuosfaasivaihdon ennen ionisointia. Sillä on NMR-spektroskopiassa useita etuja H-D-vaihtoreaktioiden analysoinnissa: materiaalia tarvitaan paljon vähemmän, näytteen konsentraatio voi olla hyvin pieni (jopa 0,1 uM), kokoraja on paljon suurempi ja tiedot voidaan yleensä kerätä ja tulkita paljon nopeammin.
Deuteriumydin on kaksi kertaa raskaampi kuin vetyydin, koska siinä on protonin lisäksi myös neutroni. Näin ollen molekyyli, joka sisältää jonkin verran deuteriumia, on raskaampi kuin molekyyli, joka sisältää pelkästään vetyä. Kun proteiini deuteroituu yhä enemmän, molekyylimassa kasvaa vastaavasti. Proteiinin massan muutoksen havaitseminen deuteroinnin yhteydessä mahdollistui nykyaikaisella proteiinien massaspektrometrialla, josta Katta ja Chait raportoivat ensimmäisen kerran vuonna 1991.
Kohdekohtaisen deuteroinnin määrittäminen massaspektrometrialla on monimutkaisempaa kuin NMR-spektroskopian avulla. Esimerkiksi deuteriumin vaihtumisen sijainti ja suhteellinen määrä pitkin peptidin selkärankaa voidaan määrittää karkeasti altistamalla proteiini proteolyysille sen jälkeen, kun vaihtumisreaktio on sammutettu. Yksittäiset peptidit analysoidaan sitten kunkin peptidifragmentin kokonaisdeuteroitumisen osalta. Tätä tekniikkaa käytettäessä deuteriuminvaihdon resoluutio määräytyy pilkkomisen aikana syntyvien peptidien koon mukaan. Proteolyysiin käytetään yleisesti pepsiiniä, joka on hapan proteaasi, koska sammutus-pH:ta on pidettävä yllä proteolyyttisen reaktion aikana. Takaisinvaihdon minimoimiseksi proteolyysi ja sitä seuraava massaspektrometrinen analyysi on tehtävä mahdollisimman nopeasti. Peptisen digestin HPLC-erotus tehdään usein matalassa lämpötilassa juuri ennen sähkösuihkumassaspektrometriaa, jotta takaisinvaihto olisi mahdollisimman pieni. Viime aikoina on käytetty UPLC:tä sen parempien erotusominaisuuksien vuoksi.
Vuonna 1999 ehdotettiin, että yksittäisen jäännöksen erottelukyky saattaisi olla mahdollista saavuttaa käyttämällä deuteroitujen peptidien yhteentörmäysindusoitua dissosiaatiofragmentointia (collision-induced dissociation, CID) yhdessä tandem-massaspektrometrian kanssa. Pian havaittiin, että CID aiheuttaa deuteriumin aseman ”sekoittumista” peptidien sisällä. MALDI in-source -hajoamisen (ISD), elektronikaappausdissosiaation (ECD) ja elektronisiirtodissosiaation (ETD) aiheuttama fragmentaatio etenee kuitenkin vain vähän tai ei lainkaan sekoittumalla oikeissa koeolosuhteissa. Isotooppimerkinnän sekoittuminen johtuu ionin dissosioitumista edeltävästä törmäyskuumennuksesta, ja vaikka CID aiheuttaa sekoittumista, törmäyskuumennusta voi esiintyä myös ionisaation ja ionin kuljetuksen aikana. Ionien lämpenemistä aiheuttavien laiteparametrien huolellisella optimoinnilla vetyjen sekoittuminen voidaan kuitenkin minimoida siinä määrin, että liuosfaasin isotooppimerkintä säilyy, kunnes fragmentointi voidaan suorittaa käyttäen tekniikkaa, jossa sekoittumista ei tapahdu. Viime aikoina on tutkittu myös ultraviolettifotodissosiaatiota (UVPD) mahdollisena fragmentointitekniikkana deuteriumin paikallistamiseksi peptidien ja proteiinien sisällä. Tältä osin johtopäätökset ovat olleet ristiriitaisia, sillä vaikka on mahdollista saada UVPD-fragmentteja, joissa ei ole tapahtunut sekoittumista tietyissä olosuhteissa, toiset ovat osoittaneet, että sekoittumista voi tapahtua sekä peptideissä että proteiineissa itse UVPD-fragmentointivaiheen aikana. Tämänhetkinen teoria, joka vahvistaa näitä ilmeisiä ristiriitoja, liittyy peptidien ja proteiinien UV-säteilytyksestä mahdollisesti aiheutuvaan kahteen pirstoutumisreittiin, eli suoraan ja tilastolliseen dissosiaatioon. Toisin sanoen, jos kokeelliset olosuhteet suosivat suoraa dissosioitumista ja prekursori-ioni pidetään alhaisilla sisäisillä energioilla ennen fragmentaatiota ja sen aikana, syntyvien fragmenttien deuteriumtaso vastaa skrambleeraamatonta prekursoria. Kokeelliset olosuhteet voivat kuitenkin suosia tilastollista dissosioitumista UV-säteilytyksen aikana, erityisesti pitkillä säteilytysajoilla ja alhaisella kaasunpaineella, mikä johtaa UV-fotonien tuottaman elektronisen heräteenergian sisäiseen muuntumiseen. Tuloksena on säteilytetyn molekyylin värähtelyheräte, joka puolestaan sekoittuu.
Neutronikristallografia Muokkaa
Nopeasti vaihtuvien lajien (esim. hydroksyyliryhmien) vety-deuterium-vaihtoa voidaan mitata atomiresoluutiolla kvantitatiivisesti neutronikristallografialla ja reaaliaikaisesti, jos vaihto tapahtuu diffraktiokokeen aikana.
Korkeaintensiteettiset neutronisuihkut tuotetaan yleensä spalloimalla linac-hiukkaskiihdyttimissä, kuten Spallation Neutron Source. Neutronit diffraktioivat kiteitä samalla tavalla kuin röntgensäteet, ja niitä voidaan käyttää rakenteen määrittämiseen. Vetyatomit, joilla on biologisessa ympäristössä yhdestä nollaan elektronia, diffraktioavat röntgensäteilyä heikosti ja ovat käytännössä näkymättömiä normaaleissa koeolosuhteissa. Neutronit siroavat atomiytimistä, ja siksi ne pystyvät havaitsemaan vety- ja deuteriumatomeja.
Vetyatomit korvataan rutiininomaisesti deuteriumilla, mikä tuo mukanaan voimakkaan ja positiivisen sirontakertoimen. Usein riittää, että proteiinikiteessä korvataan höyrydiffuusiolla vain liuotin ja labiilit vetyatomit. Tällaisessa rakenteessa vaihdettavan deuteriumatomin miehitys kiteessä tarkentuu välillä 0-100 %, mikä kvantifioi suoraan vaihdon määrän.