Yksisäikeisen DNA:n puhdistaminen akryyliamidin ja elektroforeesin avulla

Yksisäikeinen DNA (ssDNA) on käyttökelpoinen aptameereissa (1), itsekokoonpanossa (2), DNA-origamissa (3), DNA-piireissä (4), hybridisaatioantureissa (5) ja DNA-robotiikassa (6). Kemiallisesti syntetisoitu DNA on oletusarvoisesti yksijuosteista.

Tässä esittelemme menetelmän ssDNA:n tuottamiseksi PCR-tuotteesta. PCR-tuotteen käyttö synteettisen DNA:n sijasta voi olla edullista, koska PCR aiheuttaa vähemmän mutaatioita kuin kemiallinen synteesi ja voi tuottaa DNA:ta, joka on pidempi kuin kemiallisen synteesin ∼120 emäksen raja. PCR-tuotteiden sekvenssipuhtaus voi myös olla huomattavasti korkeampi kuin kemiallisesti syntetisoidulla DNA:lla. Korkea sekvenssipuhtaus on kriittinen edellytys DNA-piiritekniikan korkealle suorituskyvylle (7).

Meidän yhden säikeen tuottamismenetelmämme (single-strand generation, SSG) on skaalautuva ja vaatii vain yhden puhdistusvaiheen. Siinä poistetaan ei-toivottu komplementaarinen säie ja suoritetaan kokopohjainen puhdistus alukkeen jäännöksistä ja ei-toivotuista PCR-tuotteista. SSG:tä yhteispolymeroinnin ja elektroforeesin avulla voidaan soveltaa kehittyneiden PCR-protokollien, kuten Gibson-assemblaation (8), tuotteisiin, jotta voidaan luoda pitkiä, yksisäikeisiä tuotteita, joilla on mielivaltainen sekvenssi. Tästä voi olla hyötyä DNA-origamissa ja muissa itseasennussovelluksissa.

SSG hyödyntää kaupallisesti saatavilla olevaa DNA-modifikaatiota, joka tunnetaan nimellä akrydiitti. Tämä modifikaatio lisää polymerisoituvan vinyyliryhmän, joka yhdistyy kasvavaan akryyliamidipolymeeriketjuun (9). Akrydiittimodifioitua DNA:ta on käytetty useisiin sovelluksiin, kuten kytkettävissä olevaan hydrogeeliin (10), elohopean (11) tai PDGF:n (12) talteenottoon ja tiettyjen sekvenssien elektroforeesinopeuden muuttamiseen (13). Tekniikkamme on pintapuolisesti samanlainen kuin menetelmä, jolla Churchin ryhmä immobilisoi polymeraasipesäkkeitä ohuisiin polyakryyliamidigeeleihin. Akrydiitti on kriittinen klonaalisten PCR-tuotteiden (poloniat) muodostumiselle joissakin DNA-sekvensoinnin muodoissa (14).

Tapauksissa, joissa tarvitaan merkittäviä määriä puhdasta ssDNA:ta, lähestymistapamme, jossa käytetään akrydiittimodifioituja alukkeita ja polyakryyliamidin immobilisointia, on varteenotettava vaihtoehto. Osoitamme myös, että tällä tekniikalla voidaan integroida SSG, koonerotus ja elektroeluutio yhteen vaiheeseen.

Materiaalit ja menetelmät

Jos muuta ei ole mainittu, reagenssit hankittiin Sigma Aldrichilta (St. Louis, MO) ja niitä käytettiin ilman lisäpuhdistusta. DNA hankittiin IDT:ltä (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) ja sitä käytettiin ilman lisäpuhdistusta (sekvenssitiedot löytyvät lisätaulukosta S1).

Akrydiittisäikeen vangitsemisen demonstrointi

SSSG:n alustavaan demonstrointiin, joka suoritettiin akryyliamidin kanssa tapahtuvalla yhteispolymerisaatiolla ja sen jälkeisellä elektroforeesilla, muokkasimme yhden alukkeen akrydiitillä ja punaisella Cy5-fluoresenssivärillä. Toinen alukkeista ostettiin vihreällä fluoresoivalla 5′ fluoresceiinimodifikaatiolla. Kuvassa 1 esitetään, miten DNA-näyte valmistettiin sekoittamalla 100 μl 10 % denaturoivaa geeliä (esipolymeeri ennen polymerisaation aloittamista) 100 μl PCR-tuotetta (∼20 pMol tuotetta) ja sopiva massa kuivaa ureaa (5 %:n akryyliamidin loppupitoisuus, 7 M:n urean loppupitoisuus). DNA/prepolymeeri ladattiin 5 % denaturoivan PAGE-geelin kuivaan kuoppaan. Geeli kuumennettiin jäljempänä kuvatulla tavalla, ja elektroforeesi suoritettiin vihreän fluoresoivan säikeen erottamiseksi immobilisoidusta punaisesta fluoresoivasta säikeestä. Tuloksena saatu geeli kuvattiin LED-valaistuksella varustetulla tavallisella geelikuvantamisjärjestelmällä (FluorChem Imaging System, Protein-Simple, San Jose, CA).

Yksisäikeisen säikeen tuottaminen ja puhdistus (vertikaalinen geelielektroforeesi)

PCR suoritettiin kaikissa tapauksissa Accuprime Pfx -reaktiosarjalla (Life Technologies, Grand Island, NY) käyttäen 50 nM templaattia, 10 μM kutakin aluketta ja 8 lämpösykliä. PCR-tuote denaturoitiin lisäämällä kiinteää ureaa lopulliseen 7 M:n pitoisuuteen 100 μl:n reaktiossa. Polyakryyliamidi valmistettiin kaupallisesti saatavasta varastoliuoksesta, jossa oli 40 % akryyliamidia vedessä ja akryyliamidin ja bis-akryyliamidin suhde 19:1 (Bio-Rad, Hercules, CA). Denaturoiva polyakryyliamidi valmistettiin 7 M urean, 20 % akryyliamidin ja 0,25 × TBE-puskurin loppupitoisuuksista. Polymerisaatio aloitettiin lisäämällä 1 μl TEMEDiä (N,N,N,N′,N′-tetrametyylietyleenidiamiinia) ja 10 μl 10 % ammoniumpersulfaattia 1 ml:n annokseen denaturoivaa akryyliamidiprepolymeeriä. Osa tästä seoksesta (esipolymeeri ennen polymerisaation aloittamista) sekoitettiin nopeasti 1:1 100 μl:n PCR-tuotteen (viisi 20 μl:n PCR-reaktiota valmistajan ohjeiden mukaisesti, yhdistettyinä) kanssa, jossa oli 7 M ureaa (10 %:n akryyliamidi, lopullinen pitoisuus). PCR/polymeroituva akryyliamidiseos lisättiin kuivaan kuoppaan tavallisessa pystysuorassa denaturoivassa PAGE-geelissä. PCR/denaturoivan akryyliamidin täydellinen polymerisaatio varmistettiin huuhtelemalla kuopan yläpuolella oleva tila kevyellä argon- tai 99,97-prosenttisella typpivirralla (polymerisaatiota estävän hapen syrjäyttämiseksi). ∼30 minuutin polymerisaation jälkeen asetimme elektroforeesilaitteiston. Polyakryyliamidin murskaaminen ja maseroitujen palojen lataaminen kuoppaan tuotti hyvin laajan, epäsäännöllisen muotoisen kaistan, joten tästä lähestymistavasta luovuttiin (tietoja ei ole esitetty). Polymerisaatio kuopassa oli parempi lähestymistapa. Kuumensimme juoksutuspuskurin mikroaaltouunissa kiehuvaksi ja lisäsimme kuuman (∼80°C-90°C) puskurin katodisäiliöön (kaatamalla kuumaa puskuria täyttyneiden kuoppien päälle) edistääkseen DNA:n vapautumista kuopasta. Kuuman puskurin lisäämistä jatkettiin, kunnes geelialusta oli täynnä elektroforeesia varten tarvittavaan tilavuuteen. DNA:ta sisältävä geeli oli suorassa kosketuksessa kuumaan puskuriin, kun jännitettä käytettiin. Kuumaa puskuria olisi käytettävä nopeasti eikä sen olisi annettava jäähtyä. Tämän jälkeen suoritimme elektroforeesin kuvassa 1 esitetyn kaavion mukaisesti.

Juoksutuspuskureina voidaan käyttää SB- (5 mM natriumboraattia) ja TBE-puskureita. SB ja TBE valmistettiin RT:ssä pH:n ollessa 8,42 ja 8,36. Kun lämpötila on 80 °C, nämä pH-arvot muuttuvat vastaavasti arvoihin 8,21 ja 7,47. Tämä pH:n muutos on ohimenevä. Geeli jäähtyy 30 °C-40 °C:een elektroforeesin aikana. Tämä pH:n muutos ei aiheuttanut havaittavaa DNA:n hajoamista.

Kahden säikeen erottumisen visualisoimiseksi käytimme kahdella eri fluorofoorilla modifioituja alukkeita. Liikkuva säie muodostettiin fluoreseiinillä modifioidulla alukkeella. Liikkumattoman säikeen aluketta (akrydiitti) valmistettiin sisäisellä Cy5-modifikaatiolla. Näiden kahden väriaineen avulla pystyimme visualisoimaan erottelun etenemisen. Skannasimme tämän geelin geelikuvantamislaitteella (FluorChem Q, ProteinSimple, Santa Clara, CA) 45 minuutin elektroforeesin jälkeen 500 V:n jännitteellä.

Vaihtoehtoisena lähestymistapana PCR-tuote voidaan esikonsentroida tavallisella etanolisäyksellä. Pelletti voidaan sitten liuottaa pienempään tilavuuteen akryyliamidin esipolymeeriä. Käsissämme kaivossa tapahtuva konsentraation lisääntyminen kompensoitiin saostuksen aikana tapahtuvilla häviöillä. Joissakin tapauksissa (esim. heikon tuotekaistan kohdalla) tämä lähestymistapa voi olla suositeltavampi.

Fluoresoiva kaista, jossa on yksisäikeinen, fluoresceiinilla modifioitu tuote, leikattiin geelistä sinisellä LED-valaistuksella ∼475 nm:ssä (Bulldog Bio, Portsmouth, NH). DNA eluoitiin standardimurskaus- ja liotusmenetelmällä (15). Kun eluoitu (talteenotettu) DNA oli liian laimeaa tehokkaaseen etanolisaostukseen, konsentroimme sen uuttamalla sitä butanolilla. Tämän jälkeen tuote saostettiin etanolilla ja analysoitiin edelleen jäljempänä esitetyllä tavalla.

PAGE-analyysi

Fluoresceiinilla leimattujen yksisäikeisten tuotteiden (denaturoivalla PAGE:lla vapautettu ssDNA) puhtaus analysoitiin natiivilla PAGE:lla. Yksisäikeinen tuote resuspendoitiin 10 μl:aan ja kvantifioitiin UV-Vis-spektroskopialla. Teimme yhtä suuria molaarisia pitoisuuksia aluketta ja yksisäikeistä tuotetta ja elektroforeerasimme nämä näytteet ja 25-bp:n vihreän fluoresoivan tikapuun (Jena Bioscience, Jena, Saksa) 15-prosenttiselle natiiville PAGE-geelille, joka visualisoitiin Storm-skannerilla fluoresceiinisignaalin osalta.

Quencher-analyysi

Varmistaaksemme tarkemmin, että tuote oli todella yksisäikeinen, testasimme komplementaarisen oligonukleotidin (quench probe) hybridisaatiota, joka sisälsi 3′:n quencher-modifikaation. Oikein hybridisoituna sammutusluotain sijoittaa Iowa Blackin sammuttimen muutaman nanometrin päähän komplementaarisen säikeen 5′ fluoresceiinimodifikaatiosta. Tämä aiheuttaa fluoresenssin voimakkuuden jyrkän vähenemisen. Sammutusluotain hybridisoituu vain ssDNA:han. Jos tuote on kaksisäikeinen, hybridisaatio estyy, eikä fluoresenssi vaikuta siihen. Kolminkertaiset 10 μl:n näytteet 100 nM fluoresceiinilla modifioiduista tuotteista (PCR-tuote, SSG-tuote ja alukekontrolli) valmistettiin PCR-putkiin. Näistä mitattiin QuantiFluor-fluorometrillä (Promega, Madison, WI) fluoresenssin alkuarvot, minkä jälkeen lisättiin 1,1 mooliekvivalenttia sammutuskoetin-DNA:ta, vorteksoitiin, sentrifugoitiin ja annettiin inkuboitua noin 1 minuutin ajan. Tämän jälkeen fluoresenssi rekisteröitiin sen määrittämiseksi, tapahtuiko vaimenemista.

Aptameerien tuottamiseen käytettävien yksisäikeisten generointitekniikoiden vertailu

Varmistaaksemme tämän menetelmän tehokkuuden funktionaalisten aptameerien tuottamisessa ostimme templaatin PCR-monistusta varten tunnetusta lysotsyymiä sitovasta aptameerisekvenssistä. Monistimme tämän templaatin fluoresceiinimodifioidulla alukkeella ja akrydiittimodifioidulla käänteisalukkeella. Suoritimme SSG-protokollan edellä kuvatulla tavalla. Konjugoimme lysotsyymin 5,8 μm:n karboksylaattimodifioituihin helmiin (Bangs Labs, Fishers, IN) tavanomaisella EDC-kytkentäprotokollalla. Näitä helmiä inkuboitiin SSG-tuotteen, fluoresoivan satunnaistetun DNA:n (ei samankaltaista sekvenssiä aptameerin kanssa) ja kemiallisesti syntetisoidun fluoresoivan aptameerin kanssa, jolla oli sama sekvenssi. Inkuboimme myös päällystämättömiä helmiä kemiallisesti syntetisoidun fluoresoivan aptameerin kanssa negatiivisena kontrollina. Inkubaatioita suoritettiin 30 minuutin ajan, minkä jälkeen helmet pestiin kolme kertaa. Näille partikkeleille tehtiin virtaussytometria FACScaliburilla (BD Bioscience San Jose, CA). Fluoresenssin intensiteettien jakauma 488 nm:n valolla herätettäessä rekisteröitiin.

Yksisäikeisten säikeiden tuottaminen ja puhdistus (horisontaalinen geelielektroforeesi)

7 M urean denaturoiva polyakryyliamidigeeli valettiin horisontaalisesti aiemmin kuvatulla tavalla (16). Lyhyesti sanottuna 25 ml esipolymeeriliuosta (7 M ureaa, 6 % akryyliamidia/bis-akryyliamidia, SB-puskuri) aloitettiin 84 μl:lla APS:ää ja 20 μl:lla TEMEDiä. Geelin esipolymeeri kaadettiin vaakasuoraan muottiin. Sen jälkeen muotti asetettiin muovipussiin, joka huuhdottiin typellä. Geelin annettiin polymerisoitua 30 minuutin ajan. Fluoreseiini- ja akrydiittimerkityt DNA:t sekoitettiin 1 M natriumfosfaatissa, jonka pH oli 8,0, ja annealoitiin nostamalla lämpötila 80 °C:een ja jäähdyttämällä hitaasti 0,1 °C:n sekuntivauhdilla RT:hen. Seosta jäähdytettiin hitaasti kahden säikeen välisen molekyylien välisen hybridisaation edistämiseksi. Prepolymeeriseos (2,5 ml) aloitettiin lisäämällä 8,4 μl APS ja 2 μl TEMED. Kun se oli sekoitettu, 20 μl tätä liuosta lisättiin 5 μl DNA-liuokseen. Tämä siirrettiin sitten polyakryyliamidigeelin kuivaan kuoppaan. Sähkökenttälinjojen vääristymien välttämiseksi loput kuopat täytettiin muulla kuin DNA:ta sisältävällä akryyliamidilla. Täytetty geeli asetettiin muovipussiin ja puhdistettiin typellä. Geeliä ajettiin 10 V/cm:n jännitteellä 10 minuutin ajan. Sen jälkeen se kuvattiin sinisen LED-transilluminatorin ja digitaalikameran avulla. Jotta ssDNA saataisiin irti kuopassa olevasta ristisilloitetusta geelistä, 25 ml SB-puskuria kuumennettiin kiehuvaksi mikroaaltouunissa. Tämä kuuma puskuri kaadettiin sitten geelin päälle. Elektroforeesia jatkettiin 10 V/cm:n jännitteellä 10 minuutin ajan. Vertailua varten geeli kuvattiin uudelleen edellä kuvatulla tavalla.

Fluoreseiini- ja akrydiittimerkityn DNA:n yhdistymistä edistettiin 1 M natriumfosfaattipuskurilla. Jos DNA:ta olisi pitänyt koossa vain hybridisaatio, 7 M urea ja puskurin vaihto 5 mM SB-puskuriin elektroforeesin aikana olisi riittänyt vapauttamaan DNA:n geeliin. Sen sijaan tarvittiin lämpöä. Tämä osoitti, että liikkuva DNA-juoste liittyy tai kietoutuu geeliin pikemminkin kuin komplementaariseen DNA-juosteeseensa.

Tulokset ja keskustelu

Akrydiittimodifioitu DNA on liikkumaton elektroforeesissa

DsDNA:n PCR-tuotteen kahdesta juosteesta akrydiittinen juoste on loukussa kopolymeerissä, kun taas komplementaarinen juoste on liikkuva. Tämän osoittamiseksi PCR suoritettiin yhdellä alukkeella, joka oli muunnettu sekä akrydiitilla että punaisella fluoresoivalla väriaineella (Cy5). Käänteinen alukke oli muunnettu fluoresceiinilla. PCR-tuote polymerisoitiin denaturoivalle PAGE-geelille (5 %). Kaaviokuva prosessista on esitetty kuvassa 1. Aluksi sekä vihreä fluoresoiva että punainen fluoresoiva säie ovat yhdessä lokalisoituneet (keltaisen värinen geeli). Kun jännite kytketään, vain fluoresceiinilla leimattu tuote (vihreä) siirtyy geeliin. Akrydiitin ja Cy5-ko-merkityn säikeen (punainen) kiinnittyy lopulliseen geelikuvaan (kuva 1B). Lisäksi PCR-reaktiosta jäänyt alukkeen jäännös näkyy selvästi toisena vihreänä kaistana. Elektroforeesin jälkeen puhdas, yksijuosteinen tuote voidaan leikata ja eluoida tavanomaisten geelipuhdistusprotokollien mukaisesti.

Yksijuosteisen DNA:n verifiointi

Eristimme yksijuosteisen, fluoresceiinillä modifioidun DNA:n leikkaamalla ja eluoimalla kiinnostavan kaistan. Osoittaaksemme, että tällä menetelmällä talteenotettu tuote on yksijuosteinen, käytimme kahta eri menetelmää. Ensimmäinen menetelmä oli natiivigeelianalyysi. Kuvassa 2A on kuva natiivigeelistä, joka sisältää alukkeen, PCR-tuotteen (dsDNA) ja tällä menetelmällä puhdistetun ssDNA:n. Natiivigeelissä näkyy selvä erottelu dsDNA:n ja ssDNA:n välillä. SSG:n jälkeen akrydiitti-alkuaineella (jonka jälkeen geeli leikataan ja tuote eluoidaan) suurin osa eristetystä DNA:sta on yksijuosteista.

Vahvistimme tämän tuloksen käyttämällä vaimenninmodifioitua hybridisaatiosondia (kuva 2B). Koetin suunniteltiin siten, että sammutin saatiin ssDNA-tuotteen fluoresceiiniryhmän läheisyyteen. Hybridisaation yhteydessä vaimennusmolekyyli vähentää fluoresenssin intensiteettiä ∼90 %. Koska koetin hybridisoituu vain ssDNA:han, tämä koe osoittaa, että fluoresceiinimodifioitu tuote oli yksijuosteinen. Negatiivisena kontrollina testasimme myös dsDNA:n PCR-tuotteen. Kaksijuosteinen PCR-tuote ei kyennyt hybridisoitumaan vaimentimen koettimeen, joten sen fluoresenssi pysyi lähes muuttumattomana.

PCR:llä syntetisoidut optameerit puhdistetaan yhteispolymeroinnilla ja elektroforeesilla

Hyvin puhdasta ssDNA:ta tuotetaan SSG-tekniikallamme. Puhdistimme ssDNA-ptameerituotteet PCR:stä kahdella menetelmällä: (i) SSG:llä kopolymerisaation ja elektroforeesin avulla ja (ii) muualla kuvatulla biotiini-avidin-immobilisointitekniikalla (esim. Polysciences Technical data sheet 753) (17,18). Yksisäikeisiä aptameereja tuotettiin myös kemiallisella synteesillä. Kuvassa 3A esitetään ssDNA-aptameerit, jotka on tuotettu kolmella eri menetelmällä. Kaista 1 on merkkitikkaat kokovertailua varten. Kaistalla 2 on puhdistettua ssDNA:ta, joka on tuotettu PCR:llä akryylidiitti-alkuaineella, jota seurasi kopolymerisaatio akryyliamidilla, elektroforeesi ja geelipuhdistus. Vain yksi ssDNA:lle oikean kokoinen kaista on näkyvissä. Kaista 3 on ssDNA, joka on tuotettu PCR:llä biotinyloidulla alukkeella, jota on seurannut puhdistus avidiinilla päällystetyillä magneettihelmillä. Kaista 4 on kemiallisesti syntetisoitua DNA:ta, jolla on sama sekvenssi. SSG:stä yhteispolymeroinnilla ja elektroforeesilla puhdistettu ssDNA-ptameeri osoitti suurta ssDNA-puhtautta.

Yritimme seuraavaksi testata, tuottaako tämä menettely toiminnallisia aptameereja. Tätä varten tuotimme aiemmin kuvatun aptameerin lysotsyymiä vastaan käyttämällä PCR:ää muunnetuilla alukkeilla. Lysotsyymin vastainen ”Klooni 1” -aptameeri tuotettiin ensimmäisen kerran Ellingtonin laboratoriossa, ja se valittiin alun perin RNA-aptameeriksi (19); muut ryhmät ovat raportoineet, että DNA-sekvenssi toimii myös aptameerina (20,21). Huomasimme, että sekä PCR:llä että kemiallisella DNA-synteesillä saatiin aikaan toimiva aptameeri. Näiden ja muiden kokeiden perusteella päättelemme, että tämä on yksi harvoista poikkeustapauksista, joissa sekä RNA että sen emäs-DNA-sekvenssi sitoutuvat kohteeseen. Tämä on outo ja sattumanvarainen tulos; useimmat aptameerit eivät toimi, kun ne käännetään suoraan eri kemiaan. Nämä tulokset vahvistavat kirjallisuudessa esiintyvät lukuisat tapaukset, jotka osoittavat, että klooni 1:n anti-lyysotsyymi-aptameeri on erikoistapaus.

Virtaussytometria-analyysi osoitti myös, että SSG-puhdistettu ssDNA-ptameeri on toimiva. Kuvassa 4B esitetään lysotsyymillä päällystetyt helmet, jotka on altistettu satunnaiselle DNA:lle, kemiallisesti syntetisoidulle lysotsyymiä vastaan tarkoitetulle aptameerille tai SSG-puhdistetulle lysotsyymiä vastaan tarkoitetulle aptameerillemme. Sekä SSG-puhdistetut että kemiallisesti syntetisoidut aptameerit sitoutuivat voimakkaasti lysotsyymillä päällystettyihin helmiin, kun taas satunnainen DNA ei sitoutunut merkittävästi lysotsyymihelmiin. Tämä osoittaa, että nämä vuorovaikutukset ovat spesifisiä aptameerisekvenssille. Päällystämättömät helmet eivät osoittaneet fluoresenssia aptameerin kanssa tai ilman, mikä osoittaa, että sitoutuminen on spesifistä proteiinille.

Lämmitys vapauttaa DNA:n kuopista

Puhdistaessamme ssDNA-aptameereja PCR-tuotteesta SSG-menetelmällä geeliä oli tarpeen lämmittää DNA-elektroforeesin helpottamiseksi (ks. ”Materiaalit ja menetelmät”). Ymmärtääksemme, miksi tämä oli välttämätöntä, käytimme horisontaalista PAGE-menetelmää. Ilman kuumennusta haluttu ssDNA:n PCR-tuote säilyi kuopassa 7 M urean käytöstä ja jännitysgradientista huolimatta.

Ensimmäinen hypoteesimme oli, että tämä säilyminen johtui PCR-tuotteen 80 bp:n hybridisaatiosta. Tämän teorian testaamiseksi vähensimme komplementaarisuuden 23 bp:iin anneenaamalla fluoresceiinilla leimattua Klooni 1:n aptameeri-DNA:ta (kuvassa 4 merkitty F-aptameeriksi) 23 nukleotidin pituiseen akrydiittimodifioituun alukkeeseen (kuvassa 4 merkitty AC-Clone1-P2:ksi) ja suoritimme SSG:n yhteispolymerisaatiolla ja elektroforeesilla. Huolimatta suhteellisen lyhyestä 23 bp:n hybridisaatiosta aptameeri-DNA:ta säilyi kuoppaan merkittäviä määriä (kuva 4A, alin kaista). Tämä osoitti, että hypoteesimme oli virheellinen, sillä lyhyempi 23 bp:n hybridisaatiojakso, jonka pitäisi denaturoitua helposti 7 M ureassa, ei mahdollistanut halutun ssDNA-juosteen irtoamista kuopasta.

Testasimme seuraavaksi hypoteesia, jonka mukaan retentio oli riippuvainen pituudesta. Tässä yhteydessä hehkutimme 5′-akrydiittimodifioidun 19 nukleotidin pituisen oligonukleotidin (merkitty AC-DNA:ksi kuvassa 4) 19 nukleotidin täysin komplementaariseen, fluoresceiinilla leimattuun oligonukleotidiin (merkitty F-DNA*:ksi kuvassa 4). Huolimatta samankaltaisesta hybridisaation pituudesta lyhyt DNA oli helppo puhdistaa komplementistaan denaturoivalla geelillä ilman lämpöä. Käytännöllisesti katsoen kaikki 19-nukleotidinen, fluoresceiinilla leimattu liikkuva säie pääsi geeliin (kuva 4A, keskimmäinen kaista). Sen osoittamiseksi, että akrydiittimodifioitu 19-meri säilyi, kuoppaan (ylin kaista) polymeroitiin myös sekä fluoresceiinilla että akrydiitilla modifioitu säie (kuvassa 4 merkitty AC-DNA-F), joka säilyi onnistuneesti. (katso ”Materiaalit ja menetelmät” ja lisätaulukko S1 sekvenssi- ja nimikkeistötiedot)

Elektroforeesin ensimmäisten 20 minuutin jälkeen (ilman kuumennusta) oli selvää, että suuri osa Klooni 1:n aptameeri-DNA:sta ei ollut liikkuvaa (huolimatta lyhyestä hybridisaatiopituudesta). Jotta aptameeri-DNA saatiin irrotettua polyakryyliamidista, geeliä oli lämmitettävä. Kuumensimme juoksutuspuskurin lähes kiehuvaksi mikroaaltouunissa ja kaadoimme sen sitten geelin päälle kuoppien alueelle. Tämän jälkeen elektroforeesia jatkettiin vielä 20 minuutin ajan (kuva 4B, alin kaista), jolloin aptameerikaista muuttui liikkuvaksi. Tällä uudella kaistalla oli sama liikkuvuus kuin alkuperäisellä liikkuvalla kaistalla, mikä osoittaa, että kyseessä oli sama aptameerilaji. Samoin kyseessä oli sama DNA-näyte, josta saatiin vain yksi kaista kuvassa 3A. Tämä koe osoittaa, että geeliä on lämmitettävä, jotta kaikki pitkä ssDNA vapautuu polyakryyliamidista. DNA:n jääminen kuoppaan ei johdu hybridisaatiosta vaan todennäköisesti kietoutumisesta polyakryyliamidimatriisiin.

Vaakasuora PAGE yhden säikeen tuottamiseen ja integroituun elektroeluutioon

Vaakasuoran geelin käyttö mahdollistaa elektroeluution suorittamisen sen sijaan, että tuotenauha leikattaisiin ja uutettaisiin. Toisen uuttokamman käyttö ylimääräisiä kuoppia varten elektroeluutiota ja uuttoa varten vaakasuorassa PAGE:ssa nopeutti SSG:n ja DNA:n elektroeluutiota. Suunnittelimme Inkscape-ohjelmiston avulla erillisen kammion elektroeluutiota varten, joka oli syvempi ja leveämpi kuin lastauskammio (kammioiden leikkaamiseen käytetty malli on lisäaineistossa). Malli laserleikattiin akryylistä CO2-laserleikkurilla (ks. kuva 5, A ja B).

Tyypillisesti PAGE suoritetaan käyttämällä pystysuoraa geeliä lasilevyjen välissä. Vaakasuoran PAGE-geelin valamiseksi oli välttämätöntä sulkea happi pois polymeroinnin aikana. Suoritimme polymeroinnin pussissa, joka oli täytetty typpikaasulla (tai argonilla) hapen poissulkemiseksi. Geeli valettiin kahdella kammalla, ja elektroforeesi suoritettiin tavanomaisten horisontaalisen geelielektroforeesin menettelyjen mukaisesti.

Kuvassa 5C on esitetty horisontaalinen geeli SSG:tä varten yhteispolymeroinnilla ja elektroforeesilla elektroeluutiolla. Kaistat 1-4 (ylhäältäpäin) sisältävät aptameeripoolin. Kaista 5 jätettiin tyhjäksi tahattoman ristikontaminaation välttämiseksi; kaistalla 6 oli alukestandardi ei-toivotun kaistan erottamiseksi. Poolia monistettiin käyttämällä akrydiittimodifioitua aluketta ja fluoresceiinilla leimattua aluketta. Akrydiittimodifioitu säie pidettiin kuopassa. Fluoresceiinilla leimattu tuote näkyy selvästi sinisessä LED-valaistuksessa. Annoimme alukkeen kulkea uuttokuoppien läpi ja ulos geelin toiselle puolelle (ks. kuva 5D). Tuotekaistat voitiin sitten havaita lähestymässä uuttokuoppia sinisen valon transilluminisaattorissa reaaliajassa. Kun tuotenauhat tulivat kuoppiin, ne imettiin pipetillä. Prosessi kesti noin 1 h. Tämän jälkeen saostus ja talteenotto etenivät julkaistujen aptameerivalintaprotokollien mukaisesti. Näin vältyttiin erilliseltä säikeiden erotteluvaiheelta tai yön yli tapahtuvalta geelin uuttamiselta.

SsDNA:n eristämiseen dsDNA:sta on useita menetelmiä. Menetelmiä ssDNA:n puhdistamiseksi PCR-tuotteista ovat muun muassa: indusoitu liikkuvuussiirto (22), biotiini-avidiinihelmi-immobilisointi (18), selektiivinen digestio DNaasilla (23) ja PCR-alukkeiden epäsymmetrinen lisääminen (24). Näiden menetelmien kustannukset, puhtaus ja skaalautuvuus vaihtelevat. Indusoitu liikkuvuussiirtymä (22) yhdessä alukkeessa voi aiheuttaa ongelmia monistuksessa (esim. PEG-modifioidut alukkeet voivat toimia huonommin PCR:ssä), ja entsymaattinen pilkkominen DNaasilla (23) tai yhden säikeen kemiallinen katkaisu jättää epäpuhtauksia (ja tuo uuden vaiheen kokonaisprosessiin). PCR-alukkeiden epäsymmetrinen lisääminen (24) jättää tuotteeseen huomattavan määrän dsDNA:ta, ja se on erittäin altis monistusvirheille. Suosituin menetelmä on poistaa ei-toivottu, biotinyloidut säikeet käyttämällä avidiinilla päällystettyjä mikropalloja (18). Tässä menetelmässä on useita sudenkuoppia. Reagoimaton alukkeen alukkeet valtaavat helmien avidiinipaikat, ja biotiinin ja avidiinin vuorovaikutus hajoaa pitkän, kaksijuosteisen DNA:n sulamislämpötilassa (25). Tämä aiheuttaa merkittäviä dsDNA-poikkeamia. Helmiäispohjaisilla menetelmillä on huomattavat kustannukset: 1,80 dollaria/nMol avidiinihelmistä ja 0,50 dollaria/nMol biotiini-alukkeesta. SSG ko-polymerisaation ja elektroforeesin avulla vaatii vain akrydiitti-alkuaineen, joka maksaa 0,80 dollaria/nMol. Polyakryyliamidi on erittäin edullista ja skaalautuvaa. Elektroforeettinen liikkuvuus on tekniikalle ominainen toinen puhdistusulottuvuus. Sekä akrydiittimodifioitu säie että mahdolliset alukkeen jäämät poistetaan PCR-reaktiosta yhdessä vaiheessa.

Olemme osoittaneet, että SSG:tä voidaan käyttää toiminnallisen aptameerin puhdistamiseen. Tekniikkaa voitaisiin käyttää myös ssDNA-poolin puhdistamiseen DNA-aptameerien valinnan yhteydessä. Lisäksi SSG:tä voidaan käyttää myös ssDNA:n tuottamiseen affiniteettikoettien tai DNA-origamien selkärangan tuottamiseen (3). On tärkeää huomata, että kemialliseen synteesiin verrattuna DNA:n PCR-tuotannolla on paljon suurempi sekvenssiuskollisuus, mikä on ratkaisevan tärkeää esimerkiksi DNA-laskennan/DNA-piirien kaltaisissa sovelluksissa (26).

.