Tableau 1
Excitation, émission et luminosité
Si vous prévoyez d’utiliser plusieurs étiquettes fluorescentes, il est important d’en choisir une avec des pics d’émission distincts – ainsi que des pics d’excitation que vous pouvez cibler avec vos lasers disponibles. Si les pics d’émission se chevauchent, il sera difficile, voire impossible, de les différencier.
Vous voulez généralement le tag fluorescent le plus brillant dans vos spectres disponibles pour obtenir un signal clair et surmonter toute fluorescence de fond potentielle. Les valeurs de luminosité sont un produit du coefficient d’extinction de la protéine et du rendement quantique. Cependant, le nombre résultant peut être difficile à interpréter, par conséquent, la luminosité d’un tag fluorescent par rapport à un tag bien défini, comme l’EGFP, est une mesure alternative commune.
Maturation et blanchiment
La maturation définit le temps nécessaire à un tag fluorescent pour se plier correctement, former le chromophore et commencer à fluorescer. Pour les événements sensibles au temps dans les cellules vivantes, un temps de maturation court peut être important. Le Superfolder GFP (sfGFP), par exemple, peut se replier en moins de 10 minutes, tandis que le mOrange peut prendre plus de quatre heures.
Le blanchiment est une mesure de la photostabilité, c’est-à-dire le temps après lequel le chromophore perd la capacité d’émettre de la lumière après excitation. Si vous prévoyez de mener des expériences time-lapse de longue durée, envisagez une balise avec une photostabilité élevée. Le T-saphir a une demi-vie de blanchiment (t½ ; temps pour qu’un taux d’émission initial de x photons/s se réduise de moitié) de 25 secondes, mais l’EGFP est beaucoup plus stable, avec un t½ de blanchiment de 174 secondes.
Conditions environnementales
Comme la plupart des protéines, les étiquettes fluorescentes sont affectées par le pH, la température et les niveaux d’oxygène. Selon l’environnement que vous prévoyez d’utiliser, vous devrez peut-être soit ajuster légèrement les conditions, soit sélectionner un tag plus approprié.
Le pH peut affecter les pics d’excitation et d’émission, et la majorité des tags fluorescents sont sensibles à l’acide : certains peuvent même changer d’intensité de fluorescence lors des changements de pH (ex : pHTomato). La valeur pKa est un bon indicateur de la sensibilité au pH, car elle indique le pH auquel la moitié des chromophores sont fluorescents.
En outre, la température et les niveaux d’oxygène affectent tous deux les temps de maturation : les conditions hypoxiques ont tendance à retarder les temps de maturation, tout comme les températures en dehors de la plage optimale des étiquettes fluorescentes (par exemple, l’EGFP a été optimisé pour fonctionner à 37°C). Cependant, de nouvelles étiquettes fluorescentes comme UnaG, une GFP isolée de l’anguille d’eau douce japonaise (Anguilla japonica), fluorescent même lorsque les niveaux d’oxygène sont faibles3.
Optimisation des codons
Comme la plupart des marqueurs fluorescents sont dérivés de protéines de méduses ou de coraux, plutôt que de quelque chose comme les cellules et les tissus mammaliens dans lesquels vous êtes susceptibles de les utiliser, il peut y avoir une différence inter-espèces dans les codons d’acides aminés utilisés. Cela peut conduire à une mauvaise expression et donc à un faible signal.
Heureusement, de nombreuses versions plus récentes de balises fluorescentes ont été optimisées au niveau des codons pour refléter les préférences des cellules de mammifères. Dans la GFP par exemple, Jürgen Haas et ses collègues ont amélioré le signal de 40 à 120 fois en modifiant la séquence de codons de la GFP4.
Si vous utilisez un plasmide plus ancien pour générer vos protéines de fusion, il se peut qu’il ne contienne pas de séquence d’étiquette fluorescente modifiée. En tant que tel, vérifiez toujours si votre séquence a été modifiée pour être utilisée dans une certaine espèce.
Oligomérisation
Il est important de déterminer si votre étiquette est un monomère ou un dimère (les monomères sont généralement désignés par un « m » préfixant le nom de la protéine, par exemple mCherry), et si cela affecte ou non votre expérience. Bon nombre des premières étiquettes fluorescentes avaient tendance à former des oligomères, et l’oligomérisation peut affecter la fonction biologique de la protéine de fusion. L’EGFP, par exemple, est un monomère qui peut former des dimères lorsqu’il est utilisé à des concentrations suffisamment élevées, ce qui peut déformer les organelles subcellulaires5 ou perturber des expériences comme le FRET6. Des FP véritablement monomères sont recommandées dans la grande majorité des cas.
Produits GFP et mCherry
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