Isolation et identification des volatiles
Le nez humain perçoit de nombreux COV comme des odeurs et ces odeurs sont souvent notre première indication de la présence de moisissures. La caractérisation chimique (isolation, séparation, identification et quantification) des COV nécessite toutefois des méthodes analytiques spécialisées, différentes des approches utilisées dans la chimie traditionnelle « humide ». Les progrès technologiques réalisés à la fin du XXe siècle et au début du XXIe siècle ont amélioré notre capacité à détecter les substances volatiles avec précision, exactitude et à de faibles concentrations (Zhang et Li, 2010 ; Hung et al., 2015). En bref, les méthodes traditionnelles impliquent la distillation à la vapeur et l’extraction liquide-liquide, suivies de la concentration et de la vérification chimique des composés individuels. Certaines des premières études sur la nature chimique des COV ont été réalisées à l’aide d’extraits de chlorure de méthylène qui ont été concentrés par distillation à la vapeur et analysés par chromatographie gaz-liquide et spectrométrie de masse (MS). Dans une première étude utilisant cette approche, les COV d’Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus oryzae et Aspergillus parasiticus ont été analysés. Les quatre espèces ont produit du 3-méthylbutanol, de la 3-octanone, du 3-octanol, du 1-octène-3-ol, du 1-octénol et du 2-octène-1-ol. Pour A. niger, plus de 90% du mélange de COV identifié était constitué de 1-octen-3-ol, qui est le composé odorant qui donne aux champignons leur odeur caractéristique. Pour A. parasiticus, le 1-octen-3-ol représentait 35,6 % du mélange volatil total, tandis que le composé apparenté à huit carbones, le 2-octen-1-ol, qui a une odeur désagréable d’huile de moutarde, constituait 34,8 % (Kamiński et al., 1974).
Les méthodes reposent depuis sur la chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS), qui combine la séparation chromatographique, l’identification par les spectres de masse et la rétention chromatographique, et la quantification des échantillons volatils. Les COV présents dans l’espace de tête des cultures fongiques sont généralement recueillis par des matériaux sorptifs solides, tels que le charbon actif ou une fibre. Chaque méthode de collecte a des biais innés et peut permettre la formation d’artefacts ; en général, les composés non polaires sont préférentiellement récoltés par rapport aux composés polaires. La chromatographie en phase gazeuse peut également introduire des erreurs dans la mesure où il est parfois difficile de séparer deux composés l’un de l’autre, ce qui entraîne leur confusion. Cela a été constaté dans le cas du 2-méthyl-1-butanol et du 3-méthyl-1-butanol, isomères qui ne diffèrent que par la transposition d’un groupe méthyle (Börjesson et al., 1992). Les autres inconvénients de l’analyse GC-MS comprennent le besoin d’opérateurs qualifiés, son coût relatif et le fait qu’elle n’est pas efficace avec les COV plus réactifs (Elke et al., 1999 ; Gao et al., 2002 ; Gao et Martin, 2002 ; Rappert et Müller, 2005).
La microextraction en phase solide (SPME) est une méthode populaire et portable. Les COV sont d’abord absorbés et concentrés sur une fibre, puis plus tard acheminés vers le détecteur où la désorption se produit dans l’injecteur GC lui-même. La SPME est bien adaptée au prélèvement d’échantillons environnementaux qui sont ensuite transportés au laboratoire pour identification. Couplée à la GC-MS, c’est un moyen pratique et largement utilisé pour identifier les COV de manière qualitative à partir de cultures microbiennes ou de bâtiments contaminés (Fiedler et al., 2001 ; Wady et al., 2003 ; Jeleń et Grabarkiewicz-Szczesna, 2005). La SPME est souvent la meilleure approche pour déterminer la quantité relative d’un composé volatil cible dans une situation exploratoire, ou pour des processus d’échantillonnage répétitifs. Cependant, elle n’est pas utile pour l’identification de nouveaux composés.
De nombreuses méthodes analytiques spécialisées ont été développées qui complètent les approches classiques de GC-MS et peuvent être utiles pour des analyses ciblées. Par exemple, la spectrométrie de masse par réaction de transfert de protons (PTR-MS) est utile pour prélever rapidement des échantillons et pour détecter de faibles concentrations (Kamysek et al., 2011 ; Schwoebel et al., 2011). Cette méthode a été employée dans les sciences de l’environnement, la technologie alimentaire et le diagnostic médical (Gasperi et al., 2001 ; Cappellin et al…, 2013).
En utilisant la désorption thermique (TD)-chromatographie en phase gazeuse/spectroscopie de masse, le profil des métabolites volatils in vitro d’Aspergillus fumigatus a été caractérisé en indiquant une signature distinctive contenant les monoterpènes camphène, α- et β-pinène, et limonène ; et les composés sesquiterpènes α- et β-trans-bergamotène (Koo et al, 2014).
La spectrométrie de masse par tube à flux d’ions sélectionnés (SIFT-MS) a la capacité de détecter les COV microbiens avec rapidité et sensibilité dans un mélange gazeux modérément complexe. Elle est capable de cibler les COV à de faibles concentrations en parties par milliard et peut mesurer certains composés dans la gamme des parties par billion. Dans cette technique, les COV totaux sont ionisés dans un tube d’écoulement, ce qui ne nécessite pas de séparation chromatographique (Syhre et al., 2008 ; Chambers et al., 2011). Cette méthode a été utilisée pour quantifier les COV émis par A. fumigatus en coculture avec des bactéries que l’on trouve souvent dans les poumons humains malades. Les cultures avec A. fumigatus ont produit des quantités » copieuses » d’ammoniac et de composés organosulfurés méthanethiol (également connu sous le nom de méthylmercaptan), sulfure de diméthyle et disulfure de diméthyle (Chippendale et al., 2014).
L’extraction par distillation simultanée (SDE) comprend une courte fibre de silice recouverte de matière organique comme phase stationnaire pour concentrer les COV qui sont ensuite désorbés dans un injecteur chaud. La SDE a été utilisée pour déterminer les composants volatils dans les analyses environnementales, alimentaires, médico-légales, pétrolières, pharmaceutiques et de polymères afin d’obtenir des échantillons plus concentrés (Orav et al., 1996). Par exemple, certains composés aromatiques ont été étudiés en utilisant une combinaison de SDE et de SPME. Les composés d’arômes peuvent être analysés quantitativement par la SDE tandis que la SPME est utilisée pour un dépistage simple, rapide et de routine (Cai et al., 2001).
Le spectromètre de mobilité ionique à colonne multicapillaire (MCC-IMS) a une sensibilité de l’ordre de la partie par billion, est rapide et nécessite peu de connaissances techniques. Les métabolites caractéristiques des espèces A. fumigatus et Candida ont été différenciés dans l’analyse de l’espace de tête par cette approche (Perl et al., 2011).
Les nez électroniques (e-noses) traduisent les volatils en signaux électriques basés sur l’interaction avec les surfaces électroniques et peuvent être utilisés pour détecter des composés connus. Les nez électroniques sont composés d’un groupe de capteurs chimiques ayant des sélectivités différentes, d’une unité de prétraitement des signaux et d’un système de distinction des motifs (Gardner et Bartlett, 1994). Les différents COV forment une empreinte digitale caractéristique qui peut être distinguée par comparaison avec des modèles précédemment enregistrés dans le système de reconnaissance. L’application médicale des nez électroniques était à l’origine axée sur les agents pathogènes bactériens ou les maladies non infectieuses telles que le cancer du poumon, la bronchopneumopathie chronique obstructive et l’asthme (Valera et al., 2012). Selon l’application, des échantillons de COV provenant d’écouvillons, de crachats, de sérum, de matières fécales, d’haleine ou d’urine sont utilisés à des fins de diagnostic. Des échantillons d’haleine ont été utilisés pour la détection précoce de l’aspergillose (de Heer et al., 2013).
Il reste de nombreux défis techniques pour travailler avec les COV fongiques, et il est souvent difficile de comparer les résultats obtenus entre différents laboratoires. La même espèce fongique peut présenter des profils de COV différents en fonction de facteurs environnementaux et génétiques inconnus ou non contrôlés. En outre, le protocole expérimental utilisé peut affecter considérablement le profil des COV. Par exemple, dans le cadre de travaux sur Aspergillus flavus, de Lucca et al. (2010) ont détecté un seul terpène en utilisant la SPME pour collecter les substances volatiles avant de les soumettre à la GC-MS. Plus tard, en utilisant un concentrateur d’échantillons avant de les soumettre à un modèle d’instrument GC-MS différent, le groupe a pu discerner plusieurs terpènes (de Lucca et al., 2012). La méthode de manipulation des matériaux avant l’expérimentation peut donner lieu à des artefacts et l’autoclavage peut entraîner la formation de substances volatiles non biogènes (Börjesson et al., 1992). Comme les données sont souvent incohérentes d’un essai à l’autre, certains auteurs ont mis en doute la reproductibilité des émissions microbiennes de COV (Schleibinger et al., 2002). Les travaux futurs sur les COV fongiques doivent tenir compte des nombreux facteurs qui peuvent influencer les résultats. Il serait utile que des directives pour les meilleures pratiques soient développées par la communauté des scientifiques qui étudient les COV fongiques.