Nager dans une mer de cellules : Pourquoi la génomique unicellulaire?
Les systèmes biologiques complexes résultent de la fonction coordonnée de cellules individuelles exécutant une « danse » complexe, chacune contribuant à son rôle particulier dans l’ensemble. En raison de cette complexité, la recherche sur l’expression des gènes dans les organismes, les tissus ou les populations cellulaires est souvent limitée par l’utilisation des méthodes traditionnelles de RNA-seq en vrac. En tant que scientifiques, nous comprenons intuitivement que lorsque nous « broyons et trouvons » afin de réaliser des expériences sur notre mélange dilué d’ARN, nous n’obtenons en réalité qu’une petite idée de ce qui pourrait se passer dans nos cellules d’intérêt : les différences entre les cellules ne sont pas prises en compte et l’hétérogénéité cellulaire peut être complètement masquée. En fait, l’analyse de l’expression de l’ARN en vrac décrit souvent un état inféré dans lequel aucune (ou très peu) des cellules n’existe réellement !
Peut-être êtes-vous un neuroscientifique, travaillant dans le cerveau de la souris, étudiant le développement d’une sous-population de neurones qui produisent un neurotransmetteur spécifique. Si seulement vous pouviez isoler cette population et l’analyser cellule par cellule, les résultats potentiels seraient, en effet, stimulants pour les neurones ! De même, dans le cas de la recherche sur le cancer, comment distinguer au mieux l’expression des gènes et, ce qui est peut-être plus important, l’hétérogénéité cellulaire, dans une tumeur ? Et si vous pouviez comparer non seulement les différences inter-tumorales, mais aussi intra-tumorales, et explorer les populations de cellules immunitaires liées au micro-environnement tumoral ? Cette diversité, souvent masquée par les méthodes d’analyse RNA-seq en vrac, peut être révélée en utilisant l’analyse RNA-seq de cellules uniques pour explorer spécifiquement ces populations de cellules cliniquement significatives. Les exemples d’inconvénients de l’analyse en vrac sont abondants, et la dissection des différences de type cellulaire dans la plupart, sinon la totalité, de ces systèmes biologiques complexes est essentielle à la compréhension de leurs contributions, en particulier pendant le développement et dans la progression de la maladie.
Comment isoler et analyser les cellules uniques ?
La technologie ARN-seq (scRNA-seq) unicellulaire de 10x Genomics, la solution Chromium™ Single Cell 3′, vous permet d’analyser les transcriptomes cellule par cellule grâce à l’utilisation d’un partitionnement microfluidique pour capturer des cellules uniques et préparer des bibliothèques d’ADNc à code-barres et de séquençage de nouvelle génération (NGS). Plus précisément, des cellules uniques, des réactifs de transcription inverse (RT), des billes de gel contenant des oligonucléotides à code-barres et de l’huile sont combinés sur une puce microfluidique pour former des vésicules de réaction appelées billes de gel en émulsion (GEM). Les GEM sont formées en parallèle dans les canaux microfluidiques de la puce, ce qui permet à l’utilisateur de traiter de 100 à 10 000 cellules uniques en un seul passage de 7 minutes sur l’instrument Chromium™. Il est important de noter que les cellules sont chargées à une dilution limitante afin de maximiser le nombre de GEM contenant une seule cellule pour assurer un faible taux de doublet, tout en maintenant un taux élevé de récupération des cellules pouvant atteindre ~65 %.
Chaque GEM fonctionnel contient une seule cellule, une seule bille de gel et des réactifs RT. Dans chaque vésicule de réaction GEM, une seule cellule est lysée, le Gel Bead est dissous pour libérer les oligonucléotides RT à code-barres identique dans la solution, et la transcription inverse de l’ARNm polyadénylé se produit. Par conséquent, tous les ADNc d’une cellule unique auront le même code-barres, ce qui permet de relier les lectures de séquençage aux cellules uniques d’origine. La préparation de bibliothèques NGS à partir de ces ADNc à code-barres est ensuite effectuée dans une réaction en masse très efficace. La vidéo ci-dessous donne une excellente explication visuelle de la façon dont tout cela fonctionne.
De la préparation des échantillons aux vidéos « comment faire » : Liens utiles pour commencer
Le flux de travail Chromium Single Cell 3′ commence par vos cellules d’intérêt, suivies de la construction de la bibliothèque NGS à l’aide de nos kits de réactifs et du contrôleur Chromium. La préparation de votre bibliothèque d’ADNc à code-barres (telle qu’elle est généralement décrite dans la vidéo ci-dessus) est une étape importante et, conformément au dicton « garbage in, garbage out », la préparation de suspensions cellulaires de haute qualité est essentielle pour tirer le meilleur parti de vos données RNA-seq. Si vous avez besoin d’aide pour le processus de préparation des cellules, nous disposons de plusieurs protocoles démontrés sur notre site Web, tels que la dissociation du tissu neural ou la préparation de suspensions de protoplastes de mousses pour une utilisation en scRNA-seq, et d’autres protocoles sont régulièrement ajoutés sur notre site Web d’assistance. Pour obtenir des conseils et des recommandations sur la meilleure façon de préparer vos échantillons une fois qu’ils sont en suspension, un bon point de départ est notre guide de préparation des cellules individuelles, où vous pouvez en apprendre davantage sur les meilleures pratiques et consulter un protocole général. Si vous êtes plutôt un apprenant visuel, nos vidéos » comment faire « , en particulier les chapitres 4 à 7, devraient vous aider à vous guider dans le processus de préparation des échantillons et des bibliothèques.
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Guide de préparation d’une cellule unique
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Protocoles démontrés
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Vidéos comment-à-vidéos
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Chromium™ Controller
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Guides d’utilisation
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Comment-à-vidéos
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Le logiciel Cell Ranger™
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Loupe™ Cell Browser
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Vidéos « comment »
Analyse de vos données, une cellule à la fois
Après la préparation de votre bibliothèque, le séquençage est effectué à l’aide des instruments de séquençage Illumina®. C’est alors qu’intervient la partie la plus amusante : glaner des informations biologiques à partir de vos données ARN-seq de cellule unique ! La quantité (potentiellement) massive de données que vous générez à partir de la solution Chromium Single Cell 3′ peut être facilement gérée par notre logiciel et nos outils de visualisation qui ont été conçus pour éliminer une grande partie de la conjecture – le logiciel Cell Ranger™ transforme les données de séquençage à code-barres en fichiers prêts pour l’analyse de l’expression de la cellule unique, et la visualisation est réalisée via le navigateur cellulaire Loupe™. Si vous souhaitez un tutoriel étape par étape sur l’utilisation de notre logiciel, les chapitres 8 à 11 de nos vidéos pratiques couvrent tout, du comptage des transcriptions avec le logiciel Cell Ranger à la magnifique visualisation des données avec Loupe Cell Browser. Il existe également un nombre croissant d’outils d’analyse de cellules uniques développés par la communauté, notamment Seurat, Monocle et Cell View. Lisez-en plus sur ces outils d’analyse et d’autres articles sur la cellule unique sur le blog 10x Genomics où nous soulignons les contributions importantes à la recherche, fournissons des conseils et des astuces et vous tenons au courant de tout ce qui concerne la cellule unique !
Si vous avez d’autres questions ou préoccupations concernant le démarrage de la solution Chromium Single Cell 3′, n’hésitez pas à laisser un commentaire ici ou à nous contacter directement. Qu’il s’agisse de suivre le développement d’organoïdes cérébraux, d’étudier la transplantation de moelle osseuse chez les patients atteints de leucémie myéloïde aiguë, ou de démêler une nouvelle voie pour l’auto-renouvellement des cellules souches intestinales, le nombre de publications de Chromium Single Cell augmente chaque jour, et nous sommes impatients d’entendre parler de toutes vos recherches étonnantes !
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