Amélioration de la solubilité des protéines recombinantes à l’aide de la balise MBP

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Expression dans E. Expression par E. coli

Générer une protéine recombinante nécessite l’utilisation d’un hôte d’expression et E. coli est généralement le premier choix à cet effet. La combinaison d’une génétique simple, d’une facilité de culture, d’une expression rapide et de rendements élevés en fait un hôte attrayant, tandis que l’absence d’une machinerie post-traductionnelle efficace, le biais d’utilisation des codons et la difficulté à produire des protéines de poids moléculaire élevé, le rendent désavantageux. Cependant l’un des plus grands maux de l’expression chez E.coli est l’expression insoluble – le phénomène dans lequel la surexpression recombinante entraîne la formation d’agrégats protéiques insolubles appelés corps d’inclusion.

Moyens de traiter les corps d’inclusion et d’améliorer la solubilité des protéines cibles

Lorsque des corps d’inclusion se forment, les scientifiques essaient généralement un processus encombrant appelé solubilisation et repliage des protéines in vitro pour récupérer les protéines solubles ou ils essaient d’optimiser l’expression au niveau du processus ou au niveau moléculaire pour éviter les problèmes d’insolubilité .

Les exemples d’optimisation au niveau du processus comprennent des méthodes qui ne nécessitent pas d’ingénierie de la cible. Par exemple, l’optimisation des conditions d’expression, l’ajustement des conditions de croissance et d’induction, le changement de milieux, de tampons, etc. Une alternative serait d’essayer une approche moléculaire et de manipuler la protéine cible en éliminant les éléments indésirables de sa séquence en créant des troncatures ou en mutant certains acides aminés pour rendre la protéine plus soluble. Vous pourriez également adopter une approche rationnelle de mutagenèse dirigée vers un site, basée sur des informations sur la structure, ou adopter une approche d’évolution dirigée et cribler la solubilité de mutants ponctuels, de délétions et de fragments aléatoires. Une approche meilleure et plus facile serait d’adopter une stratégie de partenaire de fusion et d’utiliser un partenaire de fusion en amont qui rendrait la protéine cible plus soluble.

Approche de partenaire de fusion pour améliorer la solubilité des protéines

En utilisant cette approche, une protéine ou un peptide difficile à exprimer est fusionné à une autre protéine stable et très soluble afin de stabiliser l’expression, avec l’idée que la protéine de fusion conduira l’expression résultante. Bien que de nombreuses protéines soient très solubles, elles ne sont pas toutes efficaces en tant qu’amplificateurs de solubilité des protéines. À cet égard, la protéine de liaison au maltose peut être un partenaire très utile pour la solubilité des protéines. Dans une étude comparative visant à étudier leurs propriétés d’amélioration de la solubilité des protéines, la balise MBP d’E. coli s’est avérée être un partenaire de solubilité des protéines beaucoup plus efficace que les protéines Glutathione-S-transférase (GST) et Thioredoxin (TRx).

Figure 1 : Recommandation des scientifiques de GenScript concernant la conception de la construction

A propos du tag MBP et de son mécanisme d’action

La MBP est une protéine d’environ 42 kDa, présente naturellement dans E. coli, codée par le gène malE, qui est responsable de l’absorption, de la décomposition et du transport de la maltodextrine, un hydrate de carbone. Développée à l’origine comme marqueur d’expression des protéines dans les années 1980, elle est connue pour améliorer de manière significative la solubilité d’une variété de protéines cibles fusionnées en aval. Bien que le mécanisme exact de l’amélioration de la solubilité des protéines par l’étiquette MBP ne soit pas clair, on sait qu’elle stabilise et protège sa protéine passagère en aval de la dégradation protéolytique pendant et après la synthèse des protéines. Les rendements cytoplasmiques des protéines fusionnées avec la MBP sont aussi généralement plus élevés car la protéine de fusion fournit des contextes fiables pour une initiation efficace de la traduction. Il est également proposé que l’étiquette MBP puisse agir comme un chaperon par des interactions à travers un point chaud exposé au solvant sur sa surface qui stabilise la protéine passager autrement insoluble.

L’utilisation de l’étiquette MBP

Bien qu’il ait été démontré que l’étiquette MBP fusionnée à l’extrémité N- ou C-terminale augmente l’expression soluble recombinante, une approche commune consiste à la fusionner à l’extrémité N-terminale. Malheureusement, comme aucune étiquette ne peut être idéale pour toutes les applications, pour augmenter la polyvalence des étiquettes et des applications en aval, des méthodes de marquage combinatoire ont été développées pour répondre à divers besoins. Deux marqueurs d’affinité exprimés en tandem, ainsi qu’un site de clivage protéasique précédant la protéine cible, permettent d’utiliser de multiples stratégies de purification. En incorporant une étiquette améliorant la solubilité en combinaison avec une étiquette de purification, on obtient des améliorations de la solubilité des protéines et des rendements d’expression, ainsi que des méthodes de purification efficace

Figure 2 : Un schéma général pour la stratégie de conception des constructions – la combinaison d’une étiquette d’affinité/solubilité à l’extrémité N-terminale, le site de clivage protéolytique suivi de la protéine cible peuvent donner de bons résultats, en particulier pour les protéines cibles insolubles. Une séquence linker peut souvent aider à résoudre les problèmes de clivage protéolytique.

Purification des protéines marquées MBP

Outre l’amélioration de la solubilité des protéines, un autre avantage de l’utilisation d’une stratégie de fusion MBP est de faciliter la purification de la protéine cible en aval. La MBP est une étiquette d’affinité naturelle qui se lie à la résine d’amylose et elle peut être utilisée pour la purification par affinité en une seule étape en se liant à l’amylose réticulée. Les protéines recombinantes fusionnées à un tag MBP et liées à l’amylose immobilisé sont généralement éluées dans des conditions non dénaturantes en utilisant du maltose .

Inconvénients de cette stratégie

• Le clivage de la protéine cible peut être un problème en raison de l’encombrement stérique de la balise MBP
• La résine d’amylose peut être fragile et relativement coûteuse
• La précipitation de la protéine cible après le clivage
• Certaines protéines de fusion MBP ne se lient pas efficacement à la résine d’amylose et même lorsqu’elles le font, les rendements peuvent être un problème

Conclusion

Bien qu’il n’existe pas de solution simple et globale pour résoudre les problèmes d’insolubilité dans l’expression E.coli, une construction bien conçue et une stratégie d’expression soigneusement élaborée peuvent vous donner la protéine soluble désirée. Le MBP est un marqueur de solubilité fiable pour la production de protéines solubles recombinantes. Si la solubilité est l’un des éléments les plus importants d’une campagne de production de protéines, l’objectif final ne doit pas toujours porter sur la solubilité. Les niveaux d’expression, l’activité protéique, la pureté, l’homogénéité et la stabilité sont autant de facteurs importants qui doivent également être pris en considération avant de se lancer dans une campagne de production de protéines recombinantes.

Peu de publications qui démontrent l’utilité de l’étiquette MBP

La production de fusokines à l’aide de la fusion MBP -Maltose-.Binding Protein Fusion Allows for High Level Bacterial Expression and Purification of Bioactive Mammalian Cytokine Derivatives (September 2014)

The rescue of aggregation-prone proteins using MBP -Rescueing aggregation-prone proteins in Escherichia coli with a dual His₆-MBP tag (May 2014)

MBP for soluble protein production in E. coli -La protéine de liaison au maltose marquée à l’hexahistidine comme partenaire de fusion pour la production de protéines recombinantes solubles dans Escherichia coli (2009)

1. Pryor, K. A.., et Leiting, B. (1997). Expression de haut niveau de la protéine soluble dans Escherichia coli en utilisant un système de fusion de double affinité His6-tag et maltose binding protein. Protein Expr. Purif. 10, 309-319
2. Routzahn, K. M. et Waugh, D. S. (2002). Effets différentiels des étiquettes d’affinité supplémentaires sur la solubilité des protéines de fusion MBP. J. Struct. Funct. Genomics 2, 83-92
3. Nallamsetty, S., Austin, B. P., Penrose, K., J., and Waugh, D. S. (2005) Gateway vectors for the production of combinatorially tagged His6-MBP fusion proteins in the cytoplasm and periplasm of Escherichia coli. Protein Sci. 14, 2964-2971
4. Esposito D, Chatterjee DK : Amélioration de l’expression des protéines solubles par l’utilisation de tags de fusion. Curr Opin Biotechnol 2006, 17:353-8.184.
5. Peti W, Page R : Stratégies pour maximiser l’expression de protéines hétérologues dans Escherichia coli avec un coût minimal. Protein Expr Purif 2007, 51:1-10.
6. Wilkes D.M., Expression et purification du premier domaine de liaison au nucléotide et de la région de liaison du produit du gène de la résistance aux médicaments humains : comparaison des fusions avec la glutathion S-transférase, la thiorédoxine et la protéine de liaison au maltose. Biochemical Journal 1999, 77-81
7. Fox JD, Kapust RB, Waugh DS : Les substitutions d’un seul acide aminé à la surface de la protéine de liaison au maltose d’Escherichia coli peuvent avoir un impact profond sur la solubilité des protéines de fusion. Protein Sci 2001, 10:622-630

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