Analyse et quantification de la fusion des myoblastes in vitro à l’aide de la coloration multiple LADD

Le tissu musculaire squelettique adulte contient une population de cellules précurseurs, appelées cellules satellites, qui sont responsables de la réparation du muscle squelettique (1-3). Les cellules satellites activées (myoblastes) migrent vers le site du traumatisme musculaire, où elles prolifèrent, se différencient et fusionnent en myotubes multinucléés (3-5). Le succès ultime de ce processus est mesuré par le degré de fusion des myoblastes résidents au cours de la différenciation terminale.

Pour évaluer expérimentalement la fusion des myoblastes in vitro, on calcule un indice de fusion basé sur la détection de l’immunofluorescence par microscopie. Des anticorps marqués par fluorescence sont utilisés pour détecter les protéines structurelles des fibres musculaires telles que la chaîne lourde de myosine (MyHC) et la desmine, ou alternativement, la phalloïdine marquée par fluorescence peut être utilisée pour visualiser la F-actine (6-9). Les noyaux sont marqués par fluorescence à l’aide d’un composé liant l’ADN tel que le Hoechst 33258. Par la suite, on calcule soit le pourcentage de noyaux dans les myocytes avec ≤3 noyaux (9), soit le pourcentage de noyaux dans les myotubes MyHC-positifs (10). Ces approches sont bien établies ; cependant, elles nécessitent une optimisation importante et longue pour générer un signal fort et spécifique pour l’antigène d’intérêt et une analyse de fusion ultérieure. Si des anticorps marqués par fluorescence sont utilisés, l’accès à un microscope à fluorescence est une exigence supplémentaire qui n’est pas disponible dans toutes les institutions. La quantification ultérieure nécessite une analyse laborieuse et longue de nombreux champs de vision afin d’obtenir un indice de fusion représentatif de la population. Ces limitations, ainsi que le coût relatif des tests basés sur les anticorps, nous ont incités à développer un test in vitro rapide et rentable pour la quantification de la fusion des myoblastes en utilisant la coloration multiple LADD largement disponible.

La coloration multiple LADD (11) est une coloration nucléaire et cytoplasmique combinée qui contient de la fuchsine et du bleu de toluidine (Cat. #70955 ; LADD Research Industries, Williston, VT). Pour nos études, le LADD frais est préparé pour contenir 0,365 g de bleu de toluidine (Cat. #89640-5G ; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) et 0,135 g de fuchsine (Cat. #47860-25G ; Sigma- Aldrich) dans un volume final de 50 ml d’éthanol à 30%. La solution est mélangée jusqu’à dissolution et ensuite filtrée à travers un papier filtre Whatman (numéro 4) (Cat. #09-825B, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). La coloration LADD peut être conservée dans un récipient en plastique ou en verre à température ambiante et peut être réutilisée. Les cellules à colorer sont lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et fixées dans de l’éthanol à 70 % pendant 10 minutes. L’éthanol est éliminé, et 500 µl de colorant LADD sont ajoutés, en veillant à couvrir entièrement les cellules. Les cellules sont incubées pendant 1 minute, après quoi le colorant est retiré et les cellules sont lavées à plusieurs reprises avec de l’eau distillée jusqu’à ce que le LADD cesse de s’infiltrer dans l’eau. Les cellules sont ensuite laissées à sécher et stockées à température ambiante jusqu’à ce qu’elles soient visualisées par microscopie optique à contraste de phase. Pour améliorer l’éclairage pendant la visualisation, les cellules colorées peuvent être immergées dans du PBS.

Pour déterminer si cette coloration peut être utilisée avec succès pour visualiser la fusion des myoblastes, des cellules C2C12 ont été cultivées jusqu’à 80% de confluence (Figure 1A) dans des conditions de culture standard (12). Le milieu a ensuite été changé pour un milieu de différenciation contenant 2 % de sérum de cheval, ce qui a entraîné la fusion en myotubes (figure 1B). La réussite de la différenciation a été confirmée par l’augmentation de l’expression de MyHC (Figure 1D) par rapport aux cellules indifférenciées (Figure 1C). Après la coloration LADD, les myoblastes C2C12 indifférenciés présentent un cytoplasme violet clair et un noyau plus sombre (Figure 1E ; flèche). Cependant, après différenciation, le cytoplasme des myotubes apparaît violet foncé (Figure 1F ; pointes de flèche), tandis que des noyaux plus clairs sont clairement visibles au sein de la cellule multinucléée (Figure 1F ; flèche). Par conséquent, après la coloration multiple LADD, des noyaux clairement définis sont observés et se distinguent aussi facilement du cytoplasme du myotube multinucléé (Figure 1F), comme visualisé à l’aide de la microscopie à fluorescence après immunocytochimie (Figure 1D).

Pour déterminer si l’analyse d’images pouvait être utilisée pour mesurer la progression de la fusion des myoblastes, des cellules C2C12 ont été différenciées pendant 6 jours, et des images de cellules colorées par LADD ont été prises à un grossissement de 200× à l’aide d’un microscope optique inversé Olympus CKX41 (Olympus Corporation, Tokyo, Japon). Comme prévu, le nombre de myocytes et de myotubes fusionnés a clairement augmenté à chaque jour de différenciation suivant (Figure 2A). Un indice de fusion a ensuite été calculé, et on a constaté que les myoblastes en cours de différenciation augmentaient progressivement leur indice de fusion de 0,45 % (jour 1) à 31,4 % (jour 6) (figure 2B). L’indice de fusion ainsi calculé se compare favorablement à l’indice calculé en utilisant l’immunocytochimie standard (pour détecter la MyHC) et la coloration nucléaire (13). Pour déterminer si le logiciel d’analyse ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) pouvait être adapté pour quantifier la surface des myofibres (comme mesure de la fusion), une macro a été développée et testée sur les images représentées par la Figure 2A. La macro est configurée comme suit puis sauvegardée :

• Ouvrir ImageJ et cliquer sur « Plugins = > Macros = > Macros de démarrage »

• Remplacer le texte existant avec le codage indiqué dans le tableau supplémentaire S1.

Les images sont ouvertes dans ImageJ, et la macro est exécutée en cliquant sur « Macros = > Exécuter la macro ». Ceci analysera les images une par une. L’utilisateur doit confirmer que le seuil a été réglé correctement ; seule la zone de la myofibre doit être analysée. Le seuil de couleur peut être modifié en éditant la ligne de macro « setThreshold(0,130) » ; en augmentant le second chiffre, davantage de zones légèrement colorées seront incluses, tandis que davantage de zones sont exclues lorsque ce chiffre est réduit. En utilisant cette méthode, la surface des myofibres a atteint 29,6 % au jour 6 (figure 2C), ce qui se compare bien à l’indice de fusion calculé pour le même point dans le temps (figure 2B). Les colorants Jenner et Giemsa peuvent également être utilisés pour colorer les myotubes pour la microscopie optique de la même manière que le LADD, cependant la coloration avec le LADD est beaucoup plus rapide, et la macro ImageJ que nous avons développée permet un meilleur contrôle des zones mesurées (14).

Pour valider davantage l’utilisation de la coloration multiple LADD pour l’analyse de la fusion, des cellules C2C12 ont été différenciées pendant 5 jours en présence ou en l’absence de 10 µM de BB94 (Cat. #ab142087 ; Abcam, Cambridge, UK), puis fixées et colorées avec LADD comme décrit précédemment. Le BB94 est un inhibiteur synthétique de la métalloprotéase matricielle, disponible dans le commerce, dont il a été démontré précédemment qu’il réduisait la fusion des myoblastes (15,16). En présence de BB94, l’indice de fusion a diminué de manière significative, passant de 50 % (contrôle DMSO) à 22 % (P < 0,05) (Figure 2D) ; l’analyse de la zone de myofibres a révélé la même tendance, avec une fusion réduite de 46 % (contrôle DMSO) à 21 % (P < 0.05) en présence de BB94 (Figure 2E).

Nous présentons ici une méthode rapide et nouvelle pour colorer à la fois la structure des myofibres et les myonucléus associés en utilisant la coloration multiple LADD. ImageJ est ensuite utilisé pour évaluer avec précision la surface des fibres musculaires comme une mesure de la fusion. Le coût relativement faible de LADD et le temps considérablement réduit requis pour le traitement et l’analyse signifie que la fusion peut maintenant être rapidement analysée dans un laboratoire standard sans avoir besoin d’immunocytochimie et de microscopie à fluorescence.