Biotinylation efficace et purification en une seule étape de facteurs de transcription marqués dans des cellules de mammifères et des souris transgéniques

Résultats

Biotinylation efficace de GATA-1 marqué dans des cellules transfectées. Le schéma pour la biotinylation spécifique in vivo des protéines marquées dans les cellules de mammifères est décrit dans la figure 1A. Selon cette procédure, une petite étiquette peptidique (23 aa) est fusionnée à la protéine d’intérêt et coexprimée dans des cellules avec BirA, une protéine-biotine ligase bactérienne (20). L’étiquette peptidique utilisée a été précédemment isolée d’une bibliothèque de peptides synthétiques criblée pour la biotinylation médiée par BirA, qui se produit spécifiquement au niveau du résidu lysine de l’étiquette (16). Les recherches dans les bases de données de protéines n’ont identifié aucune protéine naturelle possédant un motif de séquence similaire à celui du tag peptidique.

La protéine que nous avons marquée en testant ce système était le facteur de transcription hématopoïétique murin essentiel GATA-1 (pour revue, voir réf. 25). Le marqueur a été fusionné en position N-terminale à GATA-1 et exprimé sous le contrôle d’une cassette d’expression de la β-globine humaine dans les cellules MEL, qui peuvent être induites à subir une différenciation terminale des cellules érythroïdes (22). BirA a également été cloné et exprimé dans des cellules MEL en utilisant la cassette d’expression de la globine humaine. Les clones correspondant aux transfectants stables simples et doubles pour GATA-1 et BirA marqués ont été isolés et initialement criblés pour l’expression des deux constructions. Dans le cas du GATA-1, une analyse par transfert Western utilisant un anticorps anti-GATA-1 détecte la protéine marquée qui migre plus lentement ainsi que le GATA-1 endogène dans les extraits nucléaires des cellules transfectées (Fig. 1B, voies 1 et 2). L’expression de BirA a été analysée au niveau de l’ARN (données non présentées).

Nous avons ensuite testé, sur des transfectants stables sélectionnés, si la protéine GATA-1 marquée était biotinylée par BirA. L’analyse des extraits nucléaires des clones cellulaires MEL à l’aide d’un conjugué streptavidine-HRP a montré un signal robuste correspondant à la protéine GATA-1 marquée, détectable uniquement dans la voie du double transfectant GATA-1 marqué/BirA (Fig. 1B, voie 5). Aucune biotinylation du GATA-1 marqué n’est visible en l’absence de BirA (Fig. 1B, voie 6). Ces résultats confirment que la protéine BirA est synthétisée sous une forme active dans les cellules MEL transfectées. De plus, une très faible biotinylation de fond non spécifique est observée dans les extraits nucléaires des cellules MEL exprimant uniquement BirA (Fig. 1B, voie 7). Nous concluons donc que l’expression de la protéine-biotine ligase bactérienne BirA dans les cellules MEL peut biotinyler spécifiquement un facteur de transcription mammalien portant une étiquette peptidique unique.

Nous avons ensuite testé l’efficacité de la biotinylation en liant le GATA-1 étiqueté dans des extraits nucléaires bruts à des Dynabeads paramagnétiques de streptavidine (figure 1C). L’analyse du matériel élué des billes a montré que la quasi-totalité de la protéine GATA-1 marquée était liée (comparer la voie 2 aux voies 1 et 3, Fig. 1C). Reproduire le même filtre avec de la streptavidine-HRP montre une efficacité ≈100% dans la biotinylation et la capture du GATA-1 marqué par les billes (Fig. 1C, voies 4 et 5). De plus, conformément à ce qui a été observé dans la figure 1B, il y a peu de liaison de fond des protéines biotinylées endogènes aux billes, comme détecté par la streptavidine-HRP (figure 1C, voie 5). Ces données démontrent que le GATA-1 marqué est très efficacement biotinylé et récupéré à partir des extraits par liaison à la streptavidine, avec une biotinylation de fond négligeable.

Purification en une seule étape du GATA-1 biotinylé à partir d’extraits nucléaires bruts par liaison à la streptavidine. Nous avons également exploré la faisabilité d’une purification en une seule étape pour isoler le GATA-1 biotinylé à partir d’extraits nucléaires bruts en le liant directement à des billes de streptavidine sous stringence modérée (150 mM NaCl/0,3% Nonidet P-40/200 ng/μl d’albumine de sérum de poulet). Nous avons d’abord essayé une liaison témoin à partir de 5 mg d’extraits nucléaires bruts de cellules MEL exprimant uniquement BirA (figure 2, voie 4). Le matériel élué était constitué d’environ cinq bandes fortement colorées sur un fond de bandes beaucoup plus faibles (Fig. 2, voie 5). Nous avons identifié les protéines de liaison de fond en excisant toute la bande du gel et en l’analysant par chromatographie liquide en tandem MS. Les protéines ainsi identifiées sont classées dans le tableau 1 selon la fonction biologique et le compartiment cellulaire, tels que définis par le Gene Ontology Consortium (www.geneontology.org). Les résultats ont montré que les protéines de fond les plus abondantes identifiées étaient les carboxylases naturellement biotinylées et les enzymes associées, qui coïncidaient largement avec les bandes de coloration intense. Nous avons également trouvé la liaison de fond d’abondantes protéines nucléaires impliquées dans le traitement de l’ARNm, comme les facteurs d’épissage, ainsi que des protéines ribosomiques. Ensemble, ces trois classes de protéines représentaient >80% de la liaison de fond dans les conditions utilisées (Tableau 1). Il est à noter que très peu de peptides ont été identifiés comme correspondant à des facteurs impliqués dans la régulation transcriptionnelle (Tableau 1). Nous concluons que la liaison de fond aux billes de streptavidine est principalement due aux protéines biotinylées endogènes ainsi qu’aux facteurs nucléaires abondants impliqués dans le traitement de l’ARNm et la synthèse et l’assemblage des ribosomes, avec très peu de liaison non spécifique des facteurs impliqués dans la régulation/activation de la transcription.

Nous avons ensuite essayé de lier une quantité similaire d’extrait nucléaire brut (5 mg) provenant de transfectants doubles GATA-1/BirA marqués, dans les mêmes conditions (figure 2, voie 2). Le schéma de coloration de la voie avec le matériel élué (Fig. 2, voie 3) était significativement différent de celui observé avec la liaison de fond dans la voie 5, indiquant un enrichissement significatif en protéines coéluant avec le GATA-1 marqué (Fig. 2, voie 3 vs. voie 5). Le GATA-1 biotinylé et les protéines coeluches peuvent se diluer ou entrer en compétition pour la liaison avec les protéines non spécifiques observées dans le couloir 5. L’enrichissement en protéines visible dans le couloir 3 peut donc correspondre à des protéines copurifiées interagissant avec le GATA-1. Dans le matériel élué, nous avons également observé une bande fortement colorée migrant avec une taille similaire à celle attendue pour le GATA-1 marqué (Fig. 2, flèche, voie 3). Nous avons confirmé la présence de GATA-1 dans cette bande par excision du gel et par SM. L’analyse détaillée de toutes les protéines copulant avec le GATA-1 marqué sera publiée ailleurs (P.R., F.G. et J.S., résultats non publiés). Prises ensemble, ces données démontrent la biotinylation quantitative du GATA-1 marqué dans les cellules MEL et sa purification efficace à partir d’extraits protéiques bruts dans une procédure en une seule étape par liaison directe aux billes de streptavidine, avec quelques bandes de liaison de fond correspondant principalement aux protéines biotinylées endogènes et aux protéines nucléaires/nucléolaires abondantes facilement identifiables.

La biotinylation n’affecte pas les propriétés d’interaction protéique ou de liaison à l’ADN du GATA-1. Comme il est possible que l’ajout de l’étiquette peptidique et/ou la biotinylation affectent les propriétés de la protéine étiquetée, nous avons testé si le GATA-1 biotinylé pouvait encore subir des interactions protéine-protéine avec un partenaire connu du GATA-1, comme le FOG-1 (26), et s’il pouvait se lier in vivo à des cibles génétiques connues du GATA-1, comme le promoteur de la βmaj globine de la souris. Nous avons réalisé une expérience de pull-down de GATA-1 biotinylé en liant des extraits nucléaires à des billes de streptavidine et avons testé si le FOG-1 était également copurifié. Nous avons constaté que le FOG-1 était entraîné vers le bas à partir d’extraits exprimant le GATA-1 biotinylé mais pas à partir d’extraits exprimant uniquement BirA (Fig. 3A, voies 2 et 4). Nous avons également constaté que le FOG-1 se copiait avec le GATA-1 biotinylé par SM. Nous avons également réalisé une expérience de pull-down (ChIP) de la chromatine dans laquelle de la chromatine sonique provenant de cellules MEL réticulées au formaldéhyde a été incubée avec des billes de streptavidine, suivie d’une élution du matériel lié et de la récupération de l’ADN pull-down. En utilisant des amorces spécifiques du promoteur βmaj, nous avons trouvé un enrichissement pour ces séquences dans l’ADN extrait de la chromatine des cellules exprimant GATA-1 biotinylé mais pas des cellules exprimant BirA (Fig. 3B). Nous avons également constaté que la biotinylation n’affecte pas la distribution subnucléaire normalement observée avec le GATA-1 (Fig. 5, qui est publiée comme information complémentaire sur le site Web des PNAS ; réf. 27) et que le GATA-1 biotinylé affiche un profil de fractionnement biochimique identique à celui du GATA-1 endogène dans les extraits nucléaires des cellules MEL (données non présentées). Pris ensemble, ces résultats fournissent des preuves solides que les propriétés du GATA-1 ne sont pas affectées par le marquage par biotinylation. En outre, ces données démontrent également l’application du marquage par biotinylation comme une alternative aux anticorps dans les méthodes impliquant une étape de purification par affinité, comme les pull-downs de protéines ou un test ChIP.

Traçage par biotinylation chez les souris transgéniques. La possibilité d’isoler directement la protéine marquée à la biotine à partir d’extraits bruts en une seule étape soulève la perspective d’utiliser cette approche dans la purification de protéines marquées à partir de sources limitantes telles que les tissus de souris. Nous avons donc testé si le marquage par biotinylation médié par BirA fonctionnerait également in vivo chez des souris transgéniques. La surexpression de GATA-1 entraînant une létalité embryonnaire chez la souris (28), nous avons testé cette approche en marquant le facteur de transcription érythropoïétique essentiel EKLF (29). L’ADNc d’EKLF de souris a été marqué avec une étiquette de biotinylation et un double épitope d’hémagglutinine et micro-injecté dans des œufs de souris pour établir des lignées de souris transgéniques. De même, des lignées de souris transgéniques ont été établies par micro-injection de la construction de la cassette d’expression BirA/érythroïde. Les lignées de souris transgéniques présentant une expression détectable d’EKLF et de BirA marqués dans les cellules érythroïdes ont été sélectionnées et croisées. La biotinylation in vivo d’EKLF marqué a été évaluée dans des extraits nucléaires préparés à partir de foies d’embryons postcoïtum de 13,5 jours. Une analyse Western blot avec un anticorps anti-EKLF a détecté l’EKLF endogène ainsi que l’EKLF marqué, qui a été visualisé comme un doublet (Fig. 4, voie 1). La liaison des extraits nucléaires de foie fœtal aux billes de streptavidine montre que seule la bande supérieure du doublet est retenue, ce qui suggère qu’elle est biotinylée (Fig. 4, voies 2 et 3). Cette observation est confirmée en sondant le même blot avec de la streptavidine-HRP, qui ne détecte qu’une seule bande (Fig. 4, voies 7 et 9). Le doublet détecté par l’anticorps EKLF est très probablement dû à l’utilisation différentielle des codons d’initiation de la traduction au niveau de l’étiquette de biotinylation fusionnée à l’extrémité N-terminale (bande supérieure) et au niveau du double épitope de l’hémagglutinine présent immédiatement en aval, qui contient également un codon d’initiation (bande inférieure). Par conséquent, seule la bande supérieure portant la marque de biotinylation sert de substrat à BirA, ce qui démontre une fois de plus la spécificité in vivo de cette approche. La liaison d’extraits nucléaires à des billes de streptavidine a également montré qu’une proportion significative (≈50%) d’EKLF marqué est biotinylée dans les foies de souris transgéniques. Nous supposons que la différence d’efficacité de biotinylation entre les cellules transfectées et les foies foetaux (outre l’utilisation de protéines de fusion différentes) peut refléter une limitation in vivo de la disponibilité de la biotine (la biotine est abondante dans le FCS utilisé pour compléter les milieux de culture cellulaire) ou une différence dans les niveaux d’expression de BirA. Ces résultats démontrent que la biotinylation spécifique d’EKLF marqué par la BirA bactérienne peut également être réalisée avec une grande efficacité in vivo chez les souris transgéniques.

.