Centrifugation différentielle cinétiquement limitée comme alternative peu coûteuse et facilement disponible à l’élutriation centrifuge

Dans de nombreuses applications, la séparation de cellules cibles à partir de mélanges contenant d’autres cellules avec des densités similaires, mais des tailles différentes (légèrement ou substantiellement), est souhaitée. Les exemples incluent la génération de cultures cellulaires synchronisées où l’on isole les cellules à un stade particulier de leur cycle (caractérisé par leur taille) (1-2), l’isolement des corticotropes des autres cellules hypophysaires (3), et le tri de diverses sous-populations de monocytes (4). La méthode de choix pour séparer les populations cellulaires en fonction des différences de vitesse de sédimentation (surtout lorsque les différences de densité ne sont pas significatives) est un processus appelé élutriation centrifuge (5). Ici, les séparands (généralement des cellules) sont soumis à deux forces : (i) une force centrifuge qui les fait sédimenter à une vitesse qui est fonction de leur densité et de leur taille, et (ii) un flux convectif dans la direction opposée qui confère une vitesse fixe à toutes les cellules. Le flux et/ou la vitesse de centrifugation peuvent être ajustés pour ne recueillir que les cellules dont la vitesse de sédimentation se situe dans une plage particulière. Bien que ce procédé ait également été utilisé avec succès pour séparer les cellules bactériennes des matrices dans lesquelles elles sont présentes (6) (notre application d’intérêt), la nécessité d’un équipement spécialisé sert d’obstacle à de nombreux laboratoires.

Bien qu’il existe un certain nombre de protocoles qui ont été décrits pour isoler les bactéries de diverses matrices telles que les aliments (7-8), le sol (9) et les tapis microbiens (10) qui utilisent des centrifugeuses de paillasse facilement disponibles pour séparer les cellules sur la base de différentes vitesses de sédimentation, les protocoles recommandés semblent souvent être ad hoc. Par exemple, Wang et al. (8) ont recommandé une centrifugation à <1000×g pendant une durée non spécifiée pour éliminer les débris lors de l’isolement des bactéries du fromage à pâte molle, suivie d’une centrifugation à 9000×g pendant 3 min pour recueillir les bactéries. De même, pour isoler les bactéries de la viande homogénéisée, Neiderhauser et al. (7) ont recommandé une centrifugation à 100×g (pendant une durée non spécifiée) pour éliminer les particules alimentaires, suivie d’une centrifugation à 3000×g (à nouveau, pendant une durée non spécifiée) pour recueillir les bactéries. Dans d’autres cas, les protocoles recommandés impliquent plusieurs cycles de centrifugation. Par exemple, afin d’isoler les bactéries des tapis microbiens, Bey et al. (10) recommandent non seulement une centrifugation à 500×g pendant 15 minutes, mais aussi une remise en suspension du sédiment et une répétition de la procédure quatre fois. De même, pour isoler les bactéries du sol, Bakken (9) recommande une centrifugation répétée (pour un « nombre de fois ») de l’homogénat de l’échantillon à 630-1060×g (pendant une durée non spécifiée), suivie d’une remise en suspension et d’une réhomogénéisation. Des approches similaires ont également été proposées pour isoler les bactéries à partir de bouillons d’hémoculture « positifs ». Pour obtenir des isolats purs de bactéries avant de déterminer leur identité par spectrométrie de masse MALDI-TOF, Stevenson et al. (11) ont utilisé une procédure de centrifugation en plusieurs étapes impliquant des étapes de centrifugation séquentielles pendant « 1 à 2 minutes » chacune à 8500, 1000 et 13 000 RPM (valeur en g non précisée) avec remise en suspension du culot dans différents tampons à chaque étape.

Ces protocoles cités ne sont en aucun cas les seuls exemples de protocoles de centrifugation ad hoc caractérisés par un choix apparemment arbitraire des vitesses et/ou des temps de centrifugation. Une conséquence importante de ces protocoles ad hoc est qu’ils ne fournissent aucune base rationnelle avec laquelle d’autres peuvent concevoir des protocoles pour isoler différentes cellules cibles à partir d’autres matrices/mélanges de cellules. Par exemple, il est intuitivement évident qu’une centrifugation prolongée entraînera la sédimentation de toutes les particules, alors qu’une centrifugation de courte durée ne sédimentera que les particules les plus rapides, laissant la plupart des particules plus lentes dans la suspension. Déterminer la vitesse/durée optimale de la centrifugation pour isoler la particule cible tout en éliminant les autres reste cependant un art. En d’autres termes, les protocoles actuellement rapportés ne fournissent pas une base rationnelle pour la modification (détermination des vitesses/durées optimales de centrifugation) pour d’autres objectifs de séparation/isolement connexes.

Matériaux et méthodes

Théorie

Notre méthode proposée pour séparer deux types de particules qui ont des densités similaires, mais des vitesses de sédimentation différentes en raison de différences de taille, est illustrée à la figure 1. Au début du processus (Figure 1(1)), la suspension (bouillon d’hémoculture, dans notre cas) contenant les séparands (globules blancs ou WBC, globules rouges ou RBC, plaquettes et bactéries) est chargée comme une couche séparée sur un tampon clair et dense (Histopaque 1083, dans notre cas). La densité du tampon est supérieure à celle des GB (ρ = 1,06 – 1,08 g/mL (12)) et des plaquettes (ρ = 1,05 – 1,07 g/mL (13)), mais inférieure à celle des GR (ρ = 1,1 g/mL (14)) et des bactéries (ρ = 1,105 g/mL pour Escherichia coli (15)). Au fur et à mesure de la centrifugation, toutes les particules sont propulsées vers le bas, d’abord à travers la couche supérieure (milieu d’hémoculture), puis dans le tampon dense (l’Histopaque). Alors que les particules dont la densité est supérieure à celle du tampon (les GR et les bactéries) sédimentent à la fois dans le bouillon d’hémoculture et dans le tampon dense, les séparands moins denses (les GB et les plaquettes) sont exclus de ce dernier. Ce processus est similaire au protocole recommandé pour la séparation des globules blancs et des plaquettes du sang total (16). Pour notre objectif, cependant, ce processus seul est insuffisant car, alors que certaines particules indésirables (GB et plaquettes) sont séparées des particules cibles (bactéries) sur la base des différences de densité, d’autres particules ayant des densités similaires (RBC) restent. Pour atteindre notre objectif de collecter toutes les cellules cibles (bactéries) tout en éliminant toutes les particules indésirables restantes (GR), nous proposons de faire passer le système à l’état décrit dans la figure 1(4) et d’y arrêter le processus de centrifugation. Dans cet état, tous les GR, qui, en raison de leur plus grande taille, ont une vitesse de décantation plus élevée, sont déposés au fond du tube sous forme de culot, tandis que toutes les cellules bactériennes sont dispersées dans le tampon dense.

Pour atteindre cet état désiré, cependant, un certain nombre de contraintes doivent être satisfaites. Tout d’abord, afin de s’assurer que toutes les bactéries sont recueillies dans le tampon, nous devons laisser suffisamment de temps aux bactéries qui ont commencé en haut (plan A) pour migrer à travers la couche de bouillon d’hémoculture (milieu 1) et dans l’Histopaque (milieu 2). Mathématiquement, cela signifie que :

où, t est le temps pendant lequel le processus de centrifugation est exécuté, l1 est la longueur de la colonne de bouillon d’hémoculture chargée, et vb1 est la vitesse de sédimentation des bactéries dans cette couche. Ce point dans le temps (lorsque les bactéries qui commencent au plan A viennent de traverser le plan B et entrent dans le tampon) est représenté sur la figure 1(2).

Une autre caractéristique saillante de cet état est que les bactéries et les GR peuvent ne pas avoir formé de « bandes » distinctes dans le tampon à ce moment-là. Alors que les GR qui commencent sur un plan horizontal donné migrent plus loin que les bactéries situées au même endroit, les GR qui ont commencé sur le plan A peuvent ne pas avoir dépassé les bactéries qui ont commencé sur le plan B (interface entre les deux liquides). Pour que cela se produise et que les GR et les bactéries forment des bandes distinctes dans le tampon, la colonne tampon doit être suffisamment longue. Il ne sera pas possible de former des bandes distinctes si, par exemple, la colonne tampon ne s’étend que jusqu’au niveau indiqué par la ligne pointillée de la figure 1(2). Mathématiquement, la condition selon laquelle les GR (particules à sédimentation plus rapide) partant du plan A dépassent les bactéries (particules à sédimentation plus lente) partant du plan B peut être exprimée comme suit :

où l1 et l2 sont les longueurs des colonnes de bouillon d’hémoculture (milieu 1) et de tampon (milieu 2), respectivement ; vR1 et vR2 sont les vitesses de sédimentation des GR dans le bouillon et le tampon, respectivement ; et vb2 est la vitesse de sédimentation des bactéries dans le tampon. L’équation ci-dessus peut être réarrangée pour donner :

En outre, il serait souhaitable que toutes les bactéries initialement présentes dans le milieu 1 soient recueillies dans le milieu 2. Cela signifie qu’au moment où les bactéries partant du haut (plan A) traversent l’interface entre les deux phases (plan B), celles partant du plan B ne doivent pas avoir atteint le bas. Mathématiquement, cette condition s’exprime comme suit :

où, vb1 est la vitesse de sédimentation des bactéries dans le milieu 1. Ce qui précède peut être réarrangé pour donner :

Si les équations (3) et (5) sont satisfaites, alors le système atteindra l’état décrit dans la figure 1(4) où tous les GR ont atteint le fond du tube et forment une couche séparée, mais aucune des bactéries ne l’a fait. (Elles sont toutes dans le milieu 2). Cet état se produit pour la première fois lorsque tous les GR (même ceux qui commencent au plan A) ont atteint le fond du tube. Mathématiquement, cet instant dans le temps (t1) peut être représenté comme:

L’état cesse d’exister lorsque les bactéries (celles initialement présentes à l’interface c’est-à-dire au plan B) commencent à atteindre le fond du tube. Le temps que cela se produit (t2) est donné par :

Donc, pour obtenir la meilleure séparation possible, il faut (i) s’assurer que les longueurs de colonne des deux milieux satisfont aux équations (3) et (5) ; et (ii) que la durée pendant laquelle le processus de sédimentation est exécuté (tcentrifugation) est donnée par :

Poursuivre la centrifugation plus longtemps que t2 aboutira à la situation décrite par la figure 1(5), où une partie, ou la totalité, des bactéries sédimentent également au fond. Pour obtenir des isolats purs de l’espèce souhaitée, le processus de centrifugation doit être arrêté au stade correspondant à la figure 1(4), la couche supérieure éliminée et le tampon dense prélevé sans perturber le sédiment au fond. Si on le souhaite, les particules cibles peuvent être centrifugées et remises en suspension dans d’autres milieux.

Cette « fenêtre de fonctionnement » entre t1 et t2 est représentée schématiquement sur la figure 2. Ici, l’abscisse montre le temps de centrifugation, tandis que l’ordonnée montre la fraction de particules de GR et de bactéries qui sont présentes dans le tampon dense (milieu 2). Pour les deux, la fraction augmente initialement lorsqu’ils migrent de la couche supérieure, reste constante pendant un certain temps lorsqu’ils migrent en bande à travers le tampon dense, et diminue finalement lorsqu’ils se déposent au fond. Les globules rouges qui se déplacent plus rapidement ont une pente de montée/descente plus raide, ainsi qu’une période plus courte pendant laquelle ils sont tous présents dans le tampon dense. Pendant la « fenêtre de fonctionnement » (boîte nuageuse), pratiquement toutes les bactéries (∼100%) sont présentes dans le tampon, mais pratiquement aucun RBC (∼ 0%).

Les vitesses de sédimentation des RBC et des bactéries (qui déterminent les valeurs numériques des contraintes données par les équations 3,5 et 8) peuvent être prédites en fonction de leurs formes, tailles et densités respectives. La vitesse de sédimentation de est donnée (17) par l’équation:

où, ρ et ρl sont les densités de la particule et du liquide, respectivement, µ est la viscosité du liquide, R est le rayon effectif de la particule, et g est l’accélération due à la gravité/centrifugation. Les E. coli sont des bactéries en forme de bâtonnets, de 2 microns de long et de 0,5 micron de diamètre (18). Nous pouvons donc les modéliser comme des sphéroïdes allongés, dont le rayon de sédimentation effectif (R) est donné (19) par :

où a, et b sont les demi-longueurs des axes majeurs et mineurs. Ainsi, pour E. coli, a = 1 micron, et b = 0,25 micron. Sur la base de ces valeurs, nous nous attendons à ce que E. coli ait une vitesse de sédimentation de 26,7 microns/seconde à travers le liquide supérieur, et une vitesse de 6,56 microns/seconde à travers l’histopaque 1083.

D’autre part, les GR humains sont des disques biconcaves, de 7-8 microns de diamètre et de 2 microns d’épaisseur (20). Ils peuvent donc être modélisés comme des sphéroïdes oblats dont le rayon de sédimentation effectif est donné (19) par :

où, a et b sont les demi-longueurs des axes majeurs et mineurs respectivement. Avec des valeurs de 4 microns pour a, et 1 micron pour b, nous prédisons que lorsqu’ils sont soumis à une centrifugation à l’aide de notre instrument, un Eppendorf-5804, à une force centrifuge relative de 400×g, les GR sédimenteront à une vitesse de 500 microns/seconde à travers la couche supérieure de densité ∼1.02 g/mL (telle que nous l’avons mesurée), et 101 microns/seconde à travers l’Histopaque (densité = 1,083 g/mL).

La vitesse de sédimentation des particules peut être prédite plus précisément en tenant compte des interactions particule-particule. Ces interactions particule-particule se produisent lorsque le liquide déplacé vers le haut par une particule qui se dépose heurte d’autres particules immédiatement derrière ou à côté de la première, soumettant ces dernières à une traînée de fluide accrue et réduisant ainsi la vitesse de sédimentation effective (moyenne) des particules en tant que groupe. Ce phénomène est appelé « sédimentation entravée » et doit être pris en compte lorsque la fraction volumique des particules est non négligeable. Un certain nombre d’expressions semi-analytiques ou empiriques sont disponibles pour calculer les vitesses de sédimentation effectives pour les systèmes avec sédimentation entravée (21). Une de ces approches est la corrélation Richardson-Zaki, où la vitesse de sédimentation effective (v′) est donnée par :

où v est la vitesse d’établissement de la particule dans le cas non entravé, et φ est la fraction volumique des particules. Le sang est généralement dilué dans un bouillon d’hémoculture à une dilution de 1:4 (22). L’hématocrite (fraction volumique des GR dans le sang) étant généralement compris entre 0,4 et 0,45 (23), la fraction volumique résultante des GR dans notre échantillon est d’environ 0,1. Si l’on en tient compte en utilisant l’équation 12, les vitesses de sédimentation prévues pour les GR dans les milieux 1 et 2 sont respectivement de 307 microns/seconde et 62 microns/seconde. De plus, au moment où les hémocultures deviennent positives, elles contiennent ∼108 UFC (unités formant colonies) (cellules) de bactéries par mL de suspension (24). Cependant, en raison de leur petite taille (rayon ∼1 micron), leur fraction volumique reste inférieure à 0,001, et l’effet de  » décantation entravée  » peut être négligé.

Donné un volume d’échantillon à partir duquel on souhaite isoler le(s) type(s) de cellule(s) d’intérêt, l’organigramme fourni dans les matériaux supplémentaires (figure supplémentaire 1) peut être utilisé pour guider le choix du tampon de sédimentation, prédire les vitesses de sédimentation des cellules d’intérêt dans ledit tampon, déterminer le volume approprié (longueur de la colonne dans le tube de centrifugation disponible) à utiliser, et finalement calculer la durée optimale de centrifugation (fenêtre de fonctionnement) en utilisant la ou les centrifugeuses disponibles. Pour notre système (5ml de bouillon d’hémoculture « positif » chargé dans des tubes de centrifugation de 15ml), le processus est résumé dans le tableau 1.

Tableau 1. Prédictions théoriques des longueurs minimales des colonnes et des durées minimales/maximales de fonctionnement.

Validation expérimentale

Nous avons d’abord préparé un « bouillon d’hémoculture positif » synthétique en dispersant dans 8ml de milieu BACTEC Ped-Plus (Becton Dickinson, Sparks, MD), 2ml de sang frais (prélevé sur un volontaire), et 0.1ml d’une suspension contenant ∼104 CFU (cellules) par mL de E. coli K-12 et en incubant le mélange sur un mélangeur à nutation à 37°C pendant une nuit (12-14 h) pour obtenir une suspension contenant ∼109 RBCs/mL et 108 CFU/mL de bactéries. 1,5 mL du bouillon a été prélevé dans un tube de micro-centrifugation (Eppendorf, New York, USA) et les cellules ont été  » pelletées  » par centrifugation. Le surnageant a été retiré et la masse de 1 ml a été mesurée à l’aide d’une balance (OHaus® GA-110) pour estimer la densité du liquide dans le bouillon.

En outre, 5 ml du bouillon d’hémoculture positif ont été chargés sur 5 ml d’Histopaque-1083 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO USA). Plusieurs de ces tubes ont été placés dans une centrifugeuse de table Eppendorf-5804 et centrifugés pendant des durées variables (1 min, 3 min, 6 min, 10 min, 15 min, 30 min, 50 min, 70 min et 90 min). À la fin du processus de centrifugation, le tube a été retiré délicatement, la couche supérieure (bouillon d’hémoculture) a été jetée, tandis que la couche d’histopaque a été recueillie sans perturber le sédiment au fond (si présent). La concentration de bactéries dans le liquide recueilli a été déterminée à l’aide de méthodes standard comprenant la dilution en série, l’étalement sur de la gélose Tryptic Soja, l’incubation et le comptage des colonies (25). Les concentrations de GR ont été obtenues en examinant une aliquote de l’échantillon dans un hémocytomètre sous un microscope (26).

Résultats et discussion

Les résultats sont résumés dans la figure 3. Les lignes représentent le nombre théorique de cellules sanguines ou de bactéries qui devraient être présentes dans la couche d’Histopaque (moins le sédiment au fond) en fonction de nos prédictions théoriques. Les symboles pleins représentent la moyenne d’au moins trois lectures des nombres observés de RBCs (carrés), et d’E. coli (diamants). Les barres d’erreur représentent l’écart-type.

Comme on le voit sur la figure 3, le comportement observé correspond qualitativement à nos prédictions ; pour les deux particules denses (GR et bactéries), les concentrations dans l’Histopaque augmentent initialement avec le temps puis restent constantes pendant une certaine durée et enfin diminuent. On a cependant constaté que pour les GR, l’ensemble du processus (augmentation, état stable et diminution) se déroule légèrement plus lentement que prévu. L’effet de cette vitesse de sédimentation légèrement plus faible, heureusement, n’affecte pas notre fenêtre d’opération puisque le début de la fenêtre est régi par le temps nécessaire pour que toutes les bactéries entrent dans le tampon dense. Au moment où cela se produit, la concentration des GR dans le tampon dense est négligeable. En d’autres termes, on constate que la fenêtre de fonctionnement prédite par nos modèles (∼20 min à ∼75 min) se maintient.

La plupart des bactéries les plus courantes sont également assez petites (∼1 micron de longueur caractéristique) et leurs densités sont similaires. (par exemple, 1,1 g/mL pour Pseudomonas (27) ; 1,13 g/mL pour Streptococcus (28) et 1,135 g/mL pour Bacillus (29)). Ils sont donc susceptibles d’avoir des vitesses de sédimentation comparables à celles d’E. coli dans le bouillon d’hémoculture et dans l’Histopaque-1083, et par conséquent, la fenêtre d’opération devrait également être similaire. Bien que notre fenêtre de fonctionnement (∼20 min à ∼75 min) ne soit applicable que pour notre matériel et nos paramètres expérimentaux, notre analyse théorique fournit une base permettant de prédire d’autres fenêtres de fonctionnement, non seulement dans le but d’isoler des bactéries à partir de bouillons d’hémoculture positifs en utilisant différents matériels, mais aussi pour isoler d’autres cellules cibles à partir de différentes matrices en utilisant des tampons denses. Cette méthode peut également être utilisée de manière séquentielle pour isoler une cible à partir d’un mélange contenant des espèces à sédimentation rapide et à sédimentation lente. Dans de tels cas, on utiliserait notre méthode pour éliminer d’abord toutes les espèces se déplaçant plus rapidement, et par la suite, on l’utiliserait pour recueillir la cible des espèces se déposant le plus rapidement dans le mélange restant.

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