Effet de l’extrait aqueux d’Atractylodes macrocephala Koidz administré par voie orale sur la réponse inflammatoire des macrophages et des cellules T chez les souris

Abstract

Le rhizome d’Atractylodes macrocephala Koidz (AM) est un constituant de diverses prescriptions de composés renforçant le Qi. Nous avons évalué les réponses inflammatoires dans les macrophages et les cellules T isolées de souris après administration orale d’un extrait aqueux d’AM (AME). Les cellules de l’exsudat péritonéal ont été isolées à partir de souris ayant reçu une injection de thioglycollate et les altérations des récepteurs scavenger ont été examinées. Les macrophages péritonéaux ont été stimulés avec du lipopolysaccharide (LPS). Les réponses des cytokines sériques à l’injection intrapéritonéale de LPS ont également été évaluées. Les splénocytes ont été isolés et leur composition et leurs réponses fonctionnelles ont été mesurées. La teneur en atractylénolide I et en atractylénolide III, ingrédients anti-inflammatoires connus, dans l’AME était de 0,0338 mg/g d’extrait et de 0,565 mg/g d’extrait, respectivement. L’AME a augmenté le nombre de cellules SRA(+)CD11b(+) en réponse au thioglycollate. Les macrophages péritonéaux isolés du groupe AME n’ont montré aucun changement dans les marqueurs inflammatoires tels que le facteur de nécrose tumorale (TNF-) α, l’interleukine- (IL-) 6, la synthase d’oxyde nitrique inductible et la cyclooxygénase-2, mais ont montré une diminution de l’expression du CD86. Il est intéressant de noter que l’AME a diminué les taux sériques de TNF-α et d’IL-6 lors de l’injection intrapéritonéale de LPS. En ce qui concerne le système immunitaire adaptatif, l’AME a augmenté la population de cellules T CD4(+) et l’expression de la molécule de classe II du complexe majeur d’histocompatibilité dans la rate, et les splénocytes cultivés du groupe AME ont montré une production accrue d’IL-4 en même temps qu’une diminution de la production d’interféron-γ pendant l’activation des cellules T. L’AME a favorisé la reconstitution des stocks de cellules T dans le système immunitaire. L’AME a favorisé la reconstitution des macrophages péritonéaux pendant la réponse inflammatoire, mais son activité anti-inflammatoire ne semble pas être médiée par la modulation de l’activité des macrophages. L’AME a également modifié le statut immunitaire des cellules T CD4, favorisant la réponse Th2.

1. Introduction

L’inflammation est une réponse protectrice pour éliminer les stimuli nocifs, et les cellules immunitaires sont les principaux participants à ce processus. Selon la modalité de reconnaissance de l’antigène et la capacité à générer une réponse à mémoire, les cellules immunitaires sont divisées en système immunitaire inné et système immunitaire adaptatif . Les cellules immunitaires innées, telles que les macrophages et les cellules dendritiques, réagissent instantanément aux antigènes avec une spécificité limitée des récepteurs. Les cellules immunitaires adaptatives, composées de cellules T et de cellules B, sont spécifiques de l’antigène, initient une réponse à l’antigène qui a pénétré dans le tissu lymphoïde périphérique et génèrent une réponse mémoire. Les cellules immunitaires innées sont les principaux acteurs des premiers stades de l’inflammation, mais au fil du temps, les cellules immunitaires adaptatives prennent le relais.

Les macrophages résidents des tissus jouent un rôle clé dans l’immunité et l’intégrité des tissus . La plupart des macrophages tissulaires sont dérivés de précurseurs embryonnaires . Dans des conditions stables, leurs populations sont maintenues par leur longévité et par la prolifération locale, et certains macrophages sont renouvelés par des cellules dérivées de monocytes sanguins . Lors d’une inflammation, les monocytes dérivés de la moelle osseuse sont recrutés sur le site et se différencient en macrophages. Les macrophages éliminent les agents pathogènes et les antigènes par phagocytose et induisent des réponses inflammatoires en produisant des cytokines et des enzymes telles que le facteur de nécrose tumorale (TNF-) α, l’interleukine- (IL-) 6, l’oxyde nitrique synthase inductible (iNOS) et la cyclo-oxygénase- (COX-) 2. En outre, les macrophages sont un type de cellules présentatrices d’antigènes (CPA) professionnelles qui présentent des antigènes aux cellules T .

Les cellules T, qui se composent principalement de cellules T CD4 et de cellules T CD8, sont activées lorsque les récepteurs des cellules T (TCR) entrent en contact avec des peptides antigéniques liés par des molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) sur les CPA . Les cellules T CD4, qui représentent plus des deux tiers des cellules T, peuvent se différencier en diverses cellules effectrices T helper (Th) telles que Th1, Th2, Th17, T follicular helper et T regulatory cells . Parmi ces sous-ensembles, les cellules Th1 et Th2 ont été les premiers types à être définis. Les cellules Th1 sécrètent des niveaux élevés d’interféron- (IFN-) γ et sont efficaces dans la défense contre les pathogènes intracellulaires en activant les macrophages, tandis que les cellules Th2 sécrètent de l’interleukine- (IL-) 4, IL-5 et IL-13 et protègent l’hôte contre les infections helminthiques en recrutant des éosinophiles et des mastocytes. Bien que ces cellules T auxiliaires soient importantes pour la défense de l’hôte, l’activation chronique de n’importe quel type de cellule Th peut provoquer des troubles à médiation immunitaire. Les cellules Th1 jouent un rôle critique dans l’auto-immunité spécifique à un organe et les troubles inflammatoires chroniques, et les cellules Th2 sont responsables de l’inflammation allergique .

Le rhizome d’Atractylodes macrocephala Koidz (AM), appartenant aux Composées, a été utilisé pour le traitement des défauts fonctionnels du système digestif tels que la perte d’appétit, la distension abdominale et la diarrhée. Selon la médecine traditionnelle chinoise, l’AM revigore le Qi en résolvant la rétention anormale de liquide dans le tractus gastro-intestinal. AM est un composant de diverses prescriptions de composés stimulant le Qi. En médecine traditionnelle chinoise, l’une des fonctions essentielles du Qi est la défense. C’est pourquoi les herbes stimulant le Qi sont censées renforcer le système immunitaire. Étant donné que les plantes stimulant le Qi sont prises à titre préventif pour améliorer l’état immunitaire des individus ne présentant pas de déficiences manifestes, il est nécessaire d’évaluer comment le système immunitaire peut être modifié chez les individus normaux après l’administration de l’AM. Malgré son utilisation fréquente, peu d’études ont été menées pour explorer les effets de l’AM sur le système immunitaire.

L’AM contient plusieurs sesquiterpénoïdes bioactifs tels que l’atractylénolide I, l’atractylénolide II et l’atractylénolide III et des polyacétylènes . Le traitement in vitro de macrophages avec l’atractylénolide I, l’atractylénolide III et certains composés polyacétyléniques a inhibé l’expression du TNF-α et de l’iNOS induite par le lipopolysaccharide (LPS). L’administration orale de ces composants liposolubles a montré une activité anti-inflammatoire chez les souris. Cependant, la majorité des préparations traditionnelles à base de plantes sont des décoctions à base d’eau, ce qui entraîne un faible rendement en composants lipidiques solubles pharmacologiquement actifs. En outre, les polyacétylènes peuvent être facilement détruits dans l’eau bouillante. Nous avons donc voulu déterminer si des réponses anti-inflammatoires se produisent dans les macrophages isolés de souris ayant reçu de l’AM extrait dans de l’eau bouillante (AME). Nous avons également examiné l’effet de l’AME sur la réponse inflammatoire sérique. Enfin, nous avons examiné la composition et la réponse fonctionnelle des splénocytes pour toute altération du système immunitaire adaptatif après la supplémentation en AME.

2. Matériel et méthodes

2.1. Préparation de l’échantillon

L’AME originaire d’Eusung (Corée du Sud) a été acheté auprès de E-Pulip Co, Ltd. (Lot. EPL1356-4) (Séoul, Corée du Sud). Un spécimen de référence (# 2013-AM) a été déposé au Laboratory of Herbal Immunology, Kyung Hee University. En bref, 100 g d’échantillon ont été broyés, extraits avec 1 L d’eau désionisée (DW) dans un appareil à reflux et un manteau chauffant pendant 2 h à 95°C, et filtrés à travers un papier filtre Whatman numéro 2 (Whatman International, Kent, Angleterre). L’extrait a été concentré à l’aide d’un évaporateur rotatif et lyophilisé sous vide. Le rendement de l’AME était de 37,7 %. Pour l’analyse par chromatographie liquide à haute performance (HPLC), 0,4 g d’AME a été dissous dans 10 ml d’eau déminéralisée et soniqué pendant 5 min à 25°C. L’extrait a été ajouté à de l’acétate d’éthyle, secoué pour le mélanger et laissé reposer pendant 1 minute. La couche supérieure d’acétate d’éthyle a été transférée et cette procédure a été répétée trois fois. La couche finale d’acétate d’éthyle a été concentrée et lyophilisée.

2.2. HPLC

Les échantillons ont été analysés par un système HPLC en phase inverse (Shimadzu 20A, Kyoto, Japon) composé d’un échantillonneur automatique (SIL-20A), d’une pompe binaire (LC-20AD) et d’un détecteur à réseau de photodiodes (SPD-20A) et équipé d’une colonne C18 YMC-Triart (5 μm × 4,6 mm × 250 mm) (YMC, Kyoto, Japon). Les flux de gradient pour le système à deux solvants (solvant A, acide phosphorique à 0,05 % dans l’eau ; solvant B, acétonitrile) étaient les suivants : 85% A/15% B à 0 min, 85% A/15% B à 5 min, 50% A/50% B à 15 min, 50% A/50% B à 20 min, 40% A/60% B à 25 min, 40% A/60% B à 30 min, 15% A/85% à 35 min, 15% A/85% à 40 min, 85% A/15% à 42 min, et 85% A/15% à 45 min. Le débit de la phase mobile était de 1,0 ml/min avec un volume d’injection de 10 μl. La détection a été effectuée à 220 nm pour l’atractylénolide III (Sigma, St. Louis, MO, USA) ou à 280 nm pour l’atractylénolide I (Sigma).

2.3. Animaux

Des souris Balb/c mâles âgées de sept semaines ont été obtenues auprès de SamTaco (Osan, Corée du Sud) et hébergées dans une animalerie exempte d’agents pathogènes, à température et humidité contrôlées, avec un cycle lumière-obscurité de 12 heures. Tous les animaux ont subi une semaine d’adaptation avant les expériences. Les doses ont été déterminées à l’aide d’un calcul extrapolé à partir de la différence de surface corporelle entre une souris et un humain . La dose recommandée d’AM pour un humain adulte de 60 kg est de 8-24 g de plante brute par jour ou de 3-9 g d’extrait par jour (sur la base du rendement d’extraction dans cette étude). La dose pour la souris peut être déterminée comme suit : une dose équivalente pour l’homme de 50-150 mg/kg × 12,3 (le coefficient de conversion) = une dose pour la souris de 615-1 845 mg/kg. Sur la base de cette gamme de doses, nous avons choisi des doses de 500 mg/kg et 2 500 mg/kg pour cette étude. Les animaux ont été répartis au hasard dans les groupes expérimentaux. L’AME a été administré par gavage oral une fois par jour pendant 10 jours. Il n’y a pas eu de différences de poids corporel entre les groupes pendant la période expérimentale. Le protocole animal a été approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Kyung Hee (KHUASP(SE)-15-012), et les souris ont été soignées conformément aux spécifications du Conseil national de recherche américain pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (1996).

2.4. Préparation des macrophages

Pour l’isolement des macrophages, les souris ont été injectées par voie intrapéritonéale avec 2 ml de thioglycollate stérile à 3,5% (BD, Sparks, MD, USA) 4 jours avant le sacrifice. À la fin de l’expérience, les souris ont été sacrifiées par dislocation cervicale et les cellules de l’exsudat péritonéal ont été isolées aseptiquement par lavage péritonéal avec du DMEM froid (Hyclone, Logan, UT, USA) contenant 10% de sérum bovin fœtal (FBS ; Hyclone) et 1% de pénicilline-streptomycine. Après centrifugation, les cellules ont été remises en suspension et comptées à l’aide d’un compteur cellulaire TC20 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

2.5. Préparation des splénocytes

Pour l’isolement des splénocytes, les rates ont été obtenues de manière aseptique à la fin de l’expérience. Après avoir disloqué la rate entre des lames de verre dans du RPMI 1640 (Hyclone) avec 1% de FBS et 1% de pénicilline-streptomycine, les cellules ont été filtrées à travers une crépine cellulaire de 70-μm. Après centrifugation, les globules rouges ont été lysés à l’aide du tampon de lyse BD PharmLyse (BD Biosciences, San Diego, CA, USA). Les cellules ont été remises en suspension dans du RPMI 1640 avec 10% de FBS et 1% de pénicilline-streptomycine et comptées à l’aide d’un compteur de cellules T20.

2.6. Injection intrapéritonéale de LPS

Les souris ont reçu une injection intrapéritonéale de 1,3 mg/kg de LPS (sérotype 055:B5, Sigma) à la fin de l’expérience. Après 1 h, les souris ont été anesthésiées à l’éther et le sang a été prélevé par ponction cardiaque. Le sérum a été obtenu et conservé à -20°C jusqu’à l’analyse.

2.7. Culture cellulaire

Les cellules d’exsudat péritonéal ont été placées dans des plaques à 6 puits ou des plats de 60 mm et incubées pendant la nuit à 37°C. Après élimination des cellules non adhérentes, les cellules fixées ont été stimulées avec 100 ng/ml de LPS pendant 24 h. Le surnageant et les cellules ont été collectés pour les essais ultérieurs. Les splénocytes ont été plaqués dans des plaques à 24 puits et stimulés avec 2 μg/ml d’anticorps anti-CD3 (BD Biosciences) pendant 48 h. Le surnageant a été collecté pour l’analyse des cytokines.

2.8. Cytométrie en flux

Les cellules ont été lavées deux fois dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et remises en suspension à 1 × 106 cellules/ml dans un tampon FACS (PBS/0,1% NaN3/1% FBS). Les cellules ont été bloquées avec un anticorps rat anti-souris CD16/CD32 (BD Biosciences) à 4°C pendant 5 minutes, puis colorées avec un anti-souris SR-AI conjugué à la fluorescéine, un anti-souris LOX1 conjugué au PE (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), un anti-souris CD36 conjugué au PE, CD11b conjugué au PE, anti-CD11b conjugué au PE, CD86 conjugué au PE, CD4 conjugué au FITC, CD8a conjugué au PE, CD19 conjugué au FITC et IA/IE conjugué au FITC (BD Biosciences) (tous les anticorps ont été dilués à 1 :100) pendant 30 minutes sur glace dans l’obscurité. Des anticorps isotypes appariés ont été utilisés pour mettre en évidence les liaisons non spécifiques. Les cellules ont été lavées et remises en suspension dans du tampon FACS. Un total de 10 000 événements a été acquis sur un cytomètre de flux Navios (Beckman Coulter, La Brea, CA, USA), et les données ont été traitées à l’aide du logiciel Kaluza (Beckman Coulter).

2.9. Analyse des cytokines

Les niveaux de TNF-α, IL-6, IFN-γ et IL-4 dans les surnageants et les sérums ont été déterminés à l’aide des sets BD OptEIA mouse ELISA (BD Biosciences) selon le protocole du fabricant.

2.10. Essai de prolifération

Des splénocytes (4 × 105) dans des plaques à 96 puits ont été stimulés avec un mAb anti-CD3 soluble (2 μg/ml) pendant 48 h. La prolifération cellulaire a été déterminée à l’aide du kit d’essai de prolifération cellulaire CellTiter96 One Solution (Promega, Madison, WI, USA).

2.11. Isolation de l’ARN et PCR en temps réel

L’ARN total a été isolé à l’aide d’un kit de purification de l’ARN total FavorPrep (Favorgen Biotech, Pingtung, Taïwan), et l’ADNc a été transcrit par inversion à l’aide d’un kit High Capacity RNA-to-cDNA (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). L’ADNc dilué a été mélangé avec le mélange maître Power SYBR Green PCR (Applied Biosystems) et 2 pmol d’amorces spécifiques pour iNOS, COX2 ou GAPDH. L’amplification de l’ADNc a été réalisée à l’aide d’un système PCR en temps réel StepOnePlus (Applied Biosystems). Après une dénaturation thermique initiale à 95°C pendant 10 minutes, les conditions de PCR ont été fixées à 95°C pendant 15 secondes et 60°C pendant 1 minute pour 40 cycles. Pour chaque PCR, un échantillon d’ARNm correspondant sans transcription inverse a été inclus comme contrôle négatif. La quantification du nombre de copies d’ADNc a été réalisée en utilisant une courbe standard.

2.12. Analyse statistique

Les données ont été présentées sous forme d’erreur standard de la moyenne (SEM). Un test t bilatéral de Student ou une analyse de variance à deux voies ont été appliqués pour comparer les différences entre les groupes. Si l’analyse statistique montrait que les différences entre plusieurs groupes étaient significatives, le test post hoc de Tukey a été utilisé pour poursuivre la comparaison. Toutes les analyses statistiques ont été réalisées avec le logiciel IBM SPSS 22.0 version (IBM, Chicago, IL, USA). Les valeurs P inférieures à 0,05 ont été considérées comme significatives.

3. Résultats

3.1. Teneur en atractylénolide I et en atractylénolide III dans l’AME

Parmi les marqueurs de contrôle de qualité connus, l’atractylénolide I et l’atractylénolide III sont des composés anti-inflammatoires vérifiés in vitro . La fraction d’acétate d’éthyle de l’AME a été provisoirement identifiée à l’aide d’une entrée dopée de normes authentiques avec comparaison des temps de rétention et des schémas spectraux UV-visible. Les chromatogrammes HPLC sont présentés dans la figure 1. La teneur en atractylénolide I et en atractylénolide III dans l’AME était de 0,0338 mg/g d’extrait et de 0,565 mg/g d’extrait, respectivement.

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Figure 1

Chromatogrammes CLHP de l’extrait aqueux d’Atractylodes macrocephala (AME). (a, b) Marqueurs standards. (c, d) AME.

3.2. Effet de l’administration orale d’AME sur l’expression des récepteurs Scavenger dans les cellules de l’exsudat péritonéal de souris

L’injection intrapéritonéale de thioglycollate est couramment utilisée pour induire une péritonite stérile et enrichir les macrophages péritonéaux des souris en laboratoire . La majorité des macrophages péritonéaux sont dérivés des monocytes sanguins. Nous avons recueilli des cellules de l’exsudat péritonéal de souris traitées par l’AME en utilisant cette méthode. Le CD11b a été utilisé comme marqueur des macrophages. Les récepteurs Scavenger tels que SRA, CD36 et LOX-1 sont régulés à la hausse pendant la différenciation des monocytes en macrophages ; nous avons donc examiné l’expression de ces protéines. SRA, CD36 et LOX-1 étaient presque exclusivement exprimés dans les cellules CD11b(+) (Figures 2(a)-2(c)). Le pourcentage de cellules CD11b(+) SRA(+) dans le groupe témoin était de 66 %, et le traitement avec 500 mg/kg et 2 500 mg/kg d’AME a augmenté significativement cette population à 69 % et 76 %, respectivement. Les fréquences des populations de cellules CD36(+)CD11b(+) et LOX-1(+)CD11b(+) dans le groupe témoin étaient de 95 % et 14 %, respectivement, et l’AME n’a induit aucun changement significatif dans ces deux populations. L’augmentation de la population cellulaire SRA(+)CD11b(+) indique que l’AME peut stimuler la différenciation des monocytes sanguins en macrophages en réponse au thioglycollate.

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Figure 2

Récepteurs Scavenger exprimés par les cellules de l’exsudat péritonéal après administration orale d’AME. Des souris ont reçu par voie orale de l’AME (500 ou 2500 mg/kg) pendant 10 jours. Les cellules de l’exsudat péritonéal ont été isolées à partir de souris ayant reçu une injection de thioglycollate et ont été doublement colorées avec des anticorps anti-SRA conjugués au FITC et des anticorps anti-CD11b conjugués au PE (a), des anticorps anti-CD11b conjugués au FITC et des anticorps anti-CD36 conjugués au PE (b), ou des anticorps anti-CD11b conjugués au FITC et des anticorps anti-LOX-1 conjugués au PE (c). Les cellules ont été analysées par cytométrie en flux et des graphiques en points représentatifs sont présentés. (d) Les barres représentent la moyenne ± SEM (n=6). P <0,05, P<0,005 par rapport au contrôle.

3.3. Effet de l’administration orale d’AME sur l’expression du CD86 de surface dans les macrophages stimulés par le LPS

Les molécules costimulatrices telles que le CD86 sur les macrophages sont nécessaires pour renforcer la diaphonie entre les macrophages et les cellules Th . Des macrophages péritonéaux isolés de souris traitées par AME ont été stimulés par LPS pendant 24 h et l’expression membranaire de CD86 a été mesurée par cytométrie de flux. La stimulation par le LPS a augmenté l’intensité moyenne de la fluorescence du CD86 de 5,24 à 11,24 (figure 3). L’intensité moyenne de la fluorescence du CD86 dans les groupes ayant reçu 500 et 2 500 mg/kg a diminué de manière significative pour atteindre 10,14 et 10,59, respectivement. Ces résultats indiquent que l’AME peut affecter l’interaction entre les macrophages et les cellules Th.

(a)

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3.4. Effets de l’administration orale d’AME sur la réponse cytokine inflammatoire dans les macrophages et le sérum

Nous avons d’abord examiné si l’administration orale d’AME affecte la réponse inflammatoire des macrophages. Des macrophages péritonéaux du groupe témoin ou du groupe AME à forte dose ont été stimulés avec du LPS pendant 24 h et la production de TNF-α et IL-6 dans le surnageant a été mesurée. Il n’y avait pas de différence dans le niveau de sécrétion de TNF-α entre le groupe témoin et le groupe AME, mais le niveau d’IL-6 était augmenté dans le groupe AME (Figure 4(a)). Nous avons également constaté que l’AME n’induisait aucune modification de l’expression des gènes iNOS et COX-2 dans les cellules stimulées par le LPS (Figure 4(b)). Ensuite, nous avons examiné la réponse systémique des souris traitées par l’AME à la stimulation intrapéritonéale par le LPS. L’AME a diminué les taux sériques de TNF-α et d’IL-6 de 20 % et 47 %, respectivement (Figure 5). Ces résultats indiquent que l’activité anti-inflammatoire de l’AME peut se produire indépendamment de la modulation des macrophages.

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Figure 4

Effet de l’AME sur les cytokines et les enzymes inflammatoires dans les macrophages stimulés par le LPS.stimulé par des macrophages. Des macrophages isolés du groupe témoin ou du groupe AME (2500 mg/kg) ont été stimulés avec du LPS (100 ng/ml) pendant 24 h. (a) Les niveaux de facteur de nécrose tumorale- (TNF-) α et d’interleukine- (IL-) 6 dans le surnageant ont été déterminés par ELISA. (b) La PCR quantitative a été utilisée pour mesurer l’expression des gènes iNOS et COX-2. L’expression des gènes cibles a été normalisée par rapport à l’expression de la GAPDH. Les données représentent la moyenne ± SEM (n=6). (-) : sans LPS, (+) : Traitement par LPS. # P<0,005 par rapport au contrôle (-), P<0,05 par rapport au contrôle (+).

Figure 5

Effets de l’administration orale d’AME sur les réponses inflammatoires sériques après injection intrapéritonéale de LPS. L’AME (2500 mg/kg) a été administré par voie orale à des souris pendant 10 jours. Le sérum a été prélevé 1 h après l’injection intrapéritonéale de LPS (1,3 mg/kg) et les taux sériques de TNF-α et IL-6 ont été déterminés par ELISA. Les données représentent la moyenne ± SEM (n=10). (-) : sans LPS, (+) : Traitement par LPS. # P<0,001 par rapport au contrôle (-), P <0,05, P <0,001 par rapport au contrôle (+).

3.5. Effets de l’administration orale d’AME sur les populations de cellules T et B spléniques et l’expression du CMH II

Pour déterminer si l’administration orale d’AME modifie les cellules immunitaires adaptatives, nous avons analysé les pourcentages de cellules T CD4 et CD8 et de cellules B spléniques dans les groupes témoins et AME. La population de cellules T CD4(+) a augmenté de façon significative, passant de 23,4 % à 27,2 % et 26,9 % dans les groupes ayant reçu 500 et 2 500 mg/kg, respectivement (figures 6(a) et 6(d)). Aucune différence n’a été observée dans les populations de lymphocytes T CD8 et de lymphocytes B (figures 6(a), 6(b) et 6(d)). Les molécules du CMH de classe II sont nécessaires à la présentation des antigènes aux lymphocytes T CD4. Nous avons analysé l’expression splénique des molécules IA/IE du CMH de classe II de la souris et avons constaté que l’intensité de fluorescence moyenne des molécules du CMH II augmentait de manière significative, passant de 65,3 à 68,9 dans le groupe ayant reçu 2 500 mg/kg d’AME (figures 6(c) et 6(e)). Ces résultats suggèrent que l’AME induit des altérations du système immunitaire adaptatif.

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Figure 6

Effets de l’administration orale d’AME sur la composition du système immunitaire adaptatif dans la rate. Les splénocytes ont été isolés à partir de groupes de contrôle ou d’AME et doublement colorés avec un anticorps anti-CD4 conjugué au FITC et un anticorps anti-CD8 conjugué au PE (a), un anticorps anti-CD19 conjugué au FITC (b), ou un anticorps anti-MHC II conjugué au FITC (c) et évalués en utilisant la cytométrie de flux. (a-c) Des dot blots ou des histogrammes représentatifs sont présentés. (d-e) Les barres représentent la moyenne±SEM (n=6). P <0,001 par rapport au contrôle.

3.6. Effets de l’administration orale d’AME sur la prolifération des cellules T et la réponse cytokine Th1/Th2 dans les splénocytes

Nous avons étudié la fonction des cellules T spléniques après le traitement par AME. Des splénocytes isolés de groupes témoins ou de groupes AME ont été stimulés avec un anticorps anti-CD3, un mitogène qui active l’ensemble de la population des cellules T indépendamment de la spécificité du récepteur de l’antigène. Le traitement avec l’anticorps anti-CD3 pendant 48 heures a augmenté la densité optique de 2,6 fois, mesurée par le test MTS. Il n’y avait pas de différence dans la prolifération induite par l’anticorps anti-CD3 entre le groupe témoin et le groupe AME (Figure 7(a)). IFN-γ et IL-4 sont des cytokines représentatives des cellules Th1 et Th2, respectivement. Nous avons évalué la sécrétion d’IFN-γ et d’IL-4 dans les splénocytes stimulés par l’anticorps anti-CD3. Une réduction significative de la sécrétion d’IFN-γ a été observée dans le groupe AME 500 mg/kg, tandis que la sécrétion d’IL-4 était significativement augmentée dans le groupe 2 500 mg/kg (Figure 7(b)). Bien qu’aucun effet dose-dépendant n’ait été observé, l’AME a eu tendance à favoriser la réponse Th2.

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4. Discussion

Dans la médecine traditionnelle chinoise, les herbes stimulant le Qi sont censées améliorer le système immunitaire. Dans cette étude, nous nous sommes spécifiquement concentrés sur les réponses inflammatoires des macrophages et des cellules T isolées à partir de souris qui ont reçu de l’AME par voie orale.

La péritonite stérile induite par le thioglycollate a été introduite pour la première fois en 1964 par Gallily et al. et depuis lors a été la méthode la plus couramment utilisée pour l’isolement des macrophages primaires . Au quatrième jour après l’injection intrapéritonéale de thioglycollate, le nombre total de cellules de l’exsudat péritonéal est multiplié par cinq environ. Parmi ces cellules, les macrophages constituent le type cellulaire prédominant, suivis des éosinophiles. La source de l’augmentation du nombre de macrophages péritonéaux chez les souris injectées au thioglycollate est constituée par les monocytes sanguins dérivés de la moelle osseuse. La régulation positive des récepteurs scavenger se produit au cours du processus de différenciation des monocytes en macrophages. Les récepteurs scavenger, un type de récepteurs innés des macrophages, sont responsables de la phagocytose et reconnaissent spécifiquement les ligands polyanioniques. Nous avons utilisé CD11b et plusieurs marqueurs de récepteurs scavenger pour identifier les macrophages dérivés de monocytes dans les cellules de l’exsudat péritonéal et avons constaté que la population de cellules CD11b(+)SRA(+) était significativement plus importante dans le groupe AME. Cela suggère que l’administration d’AME favorise le recrutement et la différenciation des monocytes sanguins en macrophages en réponse au thioglycollate.

Le LPS est reconnu par le complexe toll-like receptor (TLR)-4/MD-2. TLR4 induit des réponses inflammatoires par l’intermédiaire de deux molécules adaptatrices, MyD88 et TRIF . La voie de signalisation dépendante de MyD88 active NF-κB et la protéine kinase activée par des agents mitogènes (MAPK) pour induire des gènes inflammatoires tels que TNF-α et IL-6. La voie de signalisation dépendante de TRIF active le facteur 3 de régulation de l’interféron pour produire de l’IFN-β, qui est nécessaire à la régulation à la hausse des molécules de costimulation. La voie de signalisation TRIF participe également à l’activation de NF-κB et MAPK, mais de manière retardée par rapport à la voie dépendante de MyD88. La régulation des molécules de costimulation est uniquement TRIF-dépendante alors que les réponses inflammatoires sont co-dépendantes de MyD88 et TRIF. Il n’y a pas eu d’effet inhibiteur sur les marqueurs inflammatoires testés dans les macrophages du groupe AME. En revanche, l’expression de CD86 a diminué. Le CD86 des macrophages se lie au CD28 des cellules Th pour renforcer l’activité de ces dernières. Nos résultats indiquent que l’administration orale d’AME n’affecte pas les réponses inflammatoires dépendantes de NF-κB- et MAPK dans les macrophages mais interfère spécifiquement avec la voie dépendante de TRIF qui conduit uniquement à l’expression de CD86. D’autres études sont nécessaires pour évaluer si l’AME provoque des altérations dans une situation pathologique où les macrophages et les cellules Th prédominent.

Le système de macrophage stimulé par le LPS est un modèle in vitro très courant pour évaluer l’activité anti-inflammatoire des produits naturels ou des candidats médicaments. En utilisant ce modèle, il est facile d’obtenir le résultat souhaité avec des composants liposolubles car ils peuvent facilement pénétrer la membrane cellulaire. Nos données ont montré que les macrophages péritonéaux isolés de souris ayant reçu de l’AME par voie orale n’ont pas montré d’effets anti-inflammatoires ex vivo, ce qui contredit les résultats in vitro précédemment rapportés. En revanche, l’activité anti-inflammatoire de l’AME a été observée dans la réponse sérique du TNF-α et de l’IL-6 après injection intrapéritonéale de LPS. Il est peu probable que cette activité anti-inflammatoire systémique soit médiée par la modulation des macrophages. L’une des différences entre les conditions in vivo et in vitro est que le LPS est transporté dans la circulation par plusieurs lipoprotéines, puis éliminé par les hépatocytes in vivo, alors que cet événement ne peut être imité in vitro . La clairance du LPS peut empêcher la surstimulation des macrophages du foie. Il reste à déterminer si l’activité anti-inflammatoire systémique de l’AME est liée à la clairance du LPS dans le foie. Un résultat similaire a été obtenu sur des macrophages péritonéaux isolés de souris ayant reçu un extrait aqueux d’Astragalus membranaceus par voie orale (données non publiées). L’Astragalus membranaceus et l’AM appartiennent à la même catégorie de plantes tonifiantes du Qi. À l’heure actuelle, nous ne savons pas si l’activité anti-inflammatoire in vivo qui n’implique pas la modulation des macrophages est propre à ces plantes médicinales ou s’il s’agit d’une propriété commune pouvant être induite par les plantes médicinales qui tonifient le Qi, et nous devons accumuler davantage de données pour tirer des conclusions. En outre, Li et al. ont signalé que l’atractylénolide I et le 14-acétoxy-12-sénécioyloxytétradéca-2E,8E,10E-trien-4,6-diyn-1-ol, un type de composé polyacétylénique isolé de l’AM, ont une structure moléculaire qui interagit avec le récepteur des glucocorticoïdes lié à la membrane. Selon leur étude, 300 mg/kg d’atractylénolide I par voie orale et 30 mg/kg de polyacétylène par voie orale étaient les doses minimales requises pour montrer des effets anti-inflammatoires . La quantité d’atractylénolide I contenue dans 2.500 mg/kg d’AME n’est que de 0,097 mg/kg, une dose bien inférieure au minimum requis. En outre, une perte de polyacétylènes a dû se produire pendant la préparation de l’AME. Il est possible que l’AME contienne des composés non identifiés de type glucocorticoïde qui contribuent à son activité anti-inflammatoire systémique.

Un nombre suffisant de cellules T est nécessaire pour maintenir une réponse immunitaire appropriée. Dans des conditions normales, le nombre total de cellules T est maintenu par la génération de cellules T naïves dans le thymus et le renouvellement des cellules T naïves périphériques et des cellules T à mémoire. Les souris et les humains subissent une atrophie du thymus avec l’âge et, par conséquent, la production de cellules T naïves diminue dans les deux espèces. Cependant, en termes de maintien des cellules T naïves, les souris produisent des cellules T naïves tout au long de leur vie, tandis que les humains adultes maintiennent cette population par la division des cellules T naïves périphériques. En outre, la durée de vie des cellules T naïves de la souris est 40 fois plus courte que celle de leurs homologues humaines. Les cellules T à mémoire sont maintenues par division intermittente. Le mécanisme précis de survie et de prolifération homéostatique des cellules T naïves et à mémoire n’est pas complètement défini, mais il implique des signaux du complexe TCR/MHC et des cytokines telles que l’IL-7 et l’IL-15. L’effet prolongé des vaccins dépend des cellules T à mémoire alors que le traitement des conditions lymphopéniques nécessite des cellules T naïves. Nous n’avons pas déterminé si la population de cellules T CD4 spléniques qui a augmenté après le traitement par l’AME était constituée de cellules T CD4 naïves ou de cellules T CD4 à mémoire. Une caractérisation détaillée de la fraction cellulaire qui répond à l’AME permettra de préciser quelle situation est la mieux adaptée à l’application de l’AME.

À noter, une régulation simultanée à la hausse des molécules du CMH de classe II dans la rate s’est produite dans le groupe AME. Les molécules du CMH de classe II sont nécessaires pour fournir des antigènes aux cellules T CD4. Nous avons couramment constaté que la majorité des cellules exprimant le CMH de classe II dans la rate sont des cellules B et que les autres cellules sont des macrophages et des cellules dendritiques. Nous n’avons pas précisé quels types de cellules présentaient une régulation positive des molécules du CMH de classe II après l’administration de l’AME. Néanmoins, l’augmentation du nombre de cellules T CD4 et de l’expression des molécules du CMH de classe II dans la rate indique que la supplémentation en AME contribue au maintien systémique des cellules T CD4. Le rôle de l’IL-4 dans des conditions physiologiques est de renforcer la réponse anticorps en favorisant la survie et la prolifération des cellules B et de fournir une défense contre les infections helminthiques. Les splénocytes des groupes AME ont montré une production accrue d’IL-4 pendant l’activation des cellules T ex vivo, en même temps qu’une production réduite d’IFN-γ. Ces résultats suggèrent que dans des conditions normales, l’AME favorise la réponse Th2. En revanche, l’administration orale de la glycoprotéine dérivée de l’AME favorise la réponse Th1 tout en diminuant la réponse Th2 dans un modèle allergique . Il n’est pas certain que ce composé représente la totalité de l’activité de l’AME. D’autres études sont nécessaires pour déterminer si l’AME prévient ou aggrave les réponses Th2 pathologiques.

5. Conclusion

Dans cette étude, nous avons observé des changements dans les réponses des macrophages et des cellules T chez des souris normales après l’administration orale d’AME. L’AME a amélioré la différenciation des monocytes induite par le thioglycollate dans le péritoine et a supprimé les niveaux de TNF-α et d’IL-6 induits par le LPS dans le sérum. Contrairement à ces effets anti-inflammatoires systémiques, les effets anti-inflammatoires n’étaient pas évidents dans les macrophages isolés du groupe AME, à l’exception des altérations de l’expression des molécules costimulatrices. L’AME a également influencé le système immunitaire adaptatif en augmentant le nombre de cellules T CD4 et l’expression des molécules du CMH de classe II et en favorisant la réponse Th2 par rapport à la réponse Th1.

Abréviations

Data Availability

Les données utilisées pour étayer les résultats de cette étude sont disponibles sur demande auprès de l’auteur correspondant.

Conflits d’intérêts

Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d’intérêts.

Remerciements

Cette recherche a été soutenue par le programme de recherche en sciences fondamentales par le biais de la Fondation nationale de recherche de Corée financée par le ministère de l’Éducation (2014R1A1A2055052).