Essai clonogénique : quoi, pourquoi et comment

Un essai clonogénique, également connu sous le nom d’essai de formation de colonies

est un essai de survie cellulaire in vitro. Il évalue la capacité des cellules uniques à survivre et à se reproduire pour former des colonies.1 Ce test a été décrit pour la première fois dans les années 1950, où il a été utilisé pour étudier les effets des radiations sur la survie et la croissance des cellules cancéreuses et a ensuite joué un rôle essentiel en radiobiologie.2

Pour mesurer la clonogénicité, les cellules doivent être ensemencées à de très faibles densités et laissées pendant une période de 1 à 3 semaines pour que les colonies se forment. Les colonies sont ensuite fixées, colorées avec du cristal violet pour les rendre visibles, et comptées. Les courbes de survie des cellules sont tracées pour analyser les données. Aujourd’hui, les essais clonogéniques sont utilisés pour répondre à une variété de questions expérimentales, en particulier en biologie du cancer.

Ce blog met en évidence :

Comment réaliser un test clonogénique avec des considérations importantes à prendre en cours de route

Utilisation de la microscopie sans étiquette et de la détection de confluence pour évaluer le nombre et la taille des colonies à l’aide de la quantification d’image automatisée

Le test de survie clonogénique

Les tests clonogéniques sont largement utilisés dans le domaine de la recherche sur le cancer, car la formation de clones est interprétée comme un trait des cellules cancéreuses ayant des capacités d’initiation de tumeurs. Bien que ce test ait été initialement utilisé dans le domaine de la radio-biologie, il est devenu un outil standard dans la recherche sur le cancer pour évaluer la croissance cellulaire et les effets cytotoxiques ou génotoxiques de divers agents ayant une application clinique potentielle. Cela inclut les agents chimiothérapeutiques et les thérapies ciblées, seuls ou en combinaison 3.

La croissance clonogénique est également utilisée pour évaluer le caractère souche de populations cellulaires particulières, car les cellules souches sont des cellules à longue durée de vie avec un potentiel de prolifération continue. Ceci est particulièrement pertinent pour la recherche sur le cancer car les cellules souches cancéreuses sont souvent associées à la chimiorésistance, à la formation de tumeurs secondaires et à la récurrence du cancer. C’est pourquoi l’étude de la capacité des cellules souches cancéreuses à l’aide d’un test clonogénique est un outil précieux et largement utilisé pour prédire l’efficacité d’une thérapie particulière.4

Les tests clonogéniques mesurent la capacité des cellules à conserver leur intégrité reproductive sur une période prolongée. Il s’agit d’une caractéristique importante car elle révèle des effets phénotypiques qui nécessitent du temps et éventuellement plusieurs divisions cellulaires pour se développer. Cet aspect est particulièrement important dans l’analyse de la résistance thérapeutique. La résistance aux médicaments ne peut pas être identifiée en utilisant des tests de cytotoxicité à court terme5.

Comment réaliser un essai clonogénique

Les informations de cette section sont adaptées de Franken et al. (2006) qui ont publié un protocole d’essai clonogénique dans Nature Protocols1, combiné avec quelques idées de ma propre expérience acquise en réalisant plus de 60 essais clonogéniques pendant mon doctorat.

Essentiellement, il y a deux façons différentes de réaliser un essai clonogénique :

(1) Les cellules peuvent être ensemencées à de faibles densités, puis traitées pour examiner l’effet du traitement sur la clonogénicité des cellules.

(2) Les cellules peuvent être traitées pendant une période déterminée, puis réimplantées à de faibles densités dans des milieux sans traitement pour tester la capacité clonogénique.

Cette dernière est souvent utilisée pour évaluer la résistance thérapeutique après traitement. La figure 1 résume la première approche qui est la méthode traditionnelle pour réaliser un test clonogénique. Comme nous le verrons, cette méthode prend beaucoup de temps et ne fournit aucune information sur la progression de l’expérience (point final uniquement). Nous discuterons plus tard des méthodes alternatives automatisées et sans point final.

Protocole traditionnel pour les essais clonogéniques

Figure. 1 | Un résumé d’un protocole clonogénique traditionnel où les cellules sont ensemencées, traitées et ensuite la clonogénicité évaluée.

Les essais clonogéniques sont généralement effectués dans des plaques à 6 ou 24 puits. Les cellules doivent être placées de manière éparse et régulière afin que des colonies isolées puissent se former. Par conséquent, il est important d’optimiser votre densité d’ensemencement pour la taille de puits que vous avez choisie avant de réaliser votre essai clonogénique.

Un bon point de départ est de consulter la littérature pour voir si des études ont réalisé des essais clonogéniques avec votre lignée cellulaire, puis de tester cette densité de semis et deux ou trois autres. Au cours de ce processus d’optimisation, il est également important de tenir compte du point final de l’expérience (par exemple, 7 jours, 14 jours ou 21 jours) et du taux de croissance cellulaire, car vous ne voulez pas que les colonies fusionnent, ce qui perturberait la quantification et l’analyse des colonies. Les densités d’ensemencement doivent être les mêmes pour toutes les conditions de traitement dans le cadre de votre expérience.
Utiliser les bons contrôles est essentiel pour l’étape d’analyse. Il faut toujours utiliser un contrôle non traité ainsi qu’un contrôle avec véhicule seul (cela peut être du DMSO, du PBS ou tout autre solvant dans lequel votre traitement est dissous). Pour les conditions de traitement, on utilise souvent une série de dilutions. La période de traitement et la rigueur de votre traitement vous aideront à déterminer votre gamme de concentrations, ce qui nécessitera probablement une certaine optimisation. Chaque contrôle et condition expérimentale doit être effectué en trois exemplaires.

Pendant la phase de formation des colonies, vous devrez surveiller la croissance des colonies dans toutes les conditions de traitement. On considère qu’une colonie est constituée de 50 cellules ou plus et qu’elles ne sont visibles qu’au microscope. Comme ce test se déroule généralement sur une longue période, vous devrez changer vos milieux cellulaires. Au départ, les cellules sont à très faible confluence et vous n’aurez pas besoin de changer le milieu aussi régulièrement que d’habitude. Cependant, si vous ensemencez et traitez ensuite avec un médicament ou un composé, il est important de tenir compte de sa demi-vie et d’ajouter un traitement frais si nécessaire.

Pour les chercheurs qui sont intéressés par l’imagerie de la croissance de la colonie au fil du temps. Nous recommandons de regarder le CytoSMART Omni.

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Ce sont souvent les colonies dans les conditions de contrôle qui croissent le plus rapidement et vous pouvez donc utiliser ces cellules comme une indication de votre point final expérimental, c’est-à-dire terminer l’expérience avant que vos colonies commencent à fusionner et si cela se produit trop rapidement, utilisez plutôt une densité de semis plus faible pour votre expérience. Il est important de terminer l’expérience pour toutes les conditions de traitement en même temps.

Une fois que vous avez atteint votre point final expérimental, les cellules doivent être lavées doucement avec du PBS (ajoutez le PBS sur le côté du puits pour ne pas perturber les colonies), fixées et colorées avec le colorant d’intercalation de l’ADN, le cristal violet (0,5% p/v) pendant au moins 30 minutes. L’élimination de l’excès de colorant peut être difficile. La meilleure technique consiste à plonger doucement les plaques dans des béchers immergés dans l’eau jusqu’à ce que l’excès de colorant ait été éliminé et qu’il ne reste plus que des colonies violet vif. Les colonies colorées peuvent être comptées jusqu’à 50 semaines après la coloration. Prenez des photos haute résolution de vos puits pour les utiliser pour l’analyse, les présentations et les figures de publication.

Pour aider les chercheurs dans l’analyse et l’optimisation de leurs essais de formation de colonies, CytoSMART a introduit une application pour le CytoSMART Omni pour détecter les colonies dans des images (time-lapse) de plaques de puits entières à un grossissement 10X. L’imagerie time-lapse en incubateur peut fournir des informations cinétiques plutôt qu’un point final, ce qui peut fournir des informations plus détaillées sur le moment où le traitement commence à affecter les cellules. L’analyse d’image sans étiquette est utilisée pour détecter les colonies, évaluer leur taille et leur circularité. Repérer le moment où les colonies commencent à fusionner et optimiser en conséquence.

Comment analyser votre essai clonogénique

C’est vraiment aussi simple que de compter manuellement vos colonies pour chaque condition de traitement et de représenter les données sous forme de courbe de survie (vous devez utiliser au moins trois répétitions biologiques pour votre courbe).

Une courbe de survie nécessite de calculer la fraction survivante (SF) des cellules traitées (cela inclut un rapport entre les colonies formées et les cellules ensemencées) et de la représenter en fonction de la dose de traitement. Avant de pouvoir calculer la SF, l’efficacité d’ensemencement (PE) de vos cellules doit être déterminée car différentes lignées cellulaires ont des efficacités d’ensemencement différentes et cela affecte le calcul de la fraction de survie.

Le PE est le rapport entre le nombre de colonies et le nombre de cellules ensemencées dans vos cellules non traitées1. La figure 1 montre les formules PE et SF et un exemple de courbe de survie.

Le comptage manuel des colonies est fastidieux et peut être sujet à des biais, c’est pourquoi un certain nombre d’outils d’analyse d’image informatisés librement disponibles ont été développés pour analyser les images des essais clonogéniques rapidement et objectivement. Une mention digne d’intérêt est le progiciel librement disponible développé par Brzozowska et al. (2019) qui non seulement compte les colonies, mais trace également leurs distributions de taille qui est une autre couche d’informations utiles sur le comportement cellulaire (voir figure 2a).6

Une alternative au comptage et à la quantification des colonies individuelles, est de déterminer le pourcentage de la surface du puits qui est couverte par les colonies (pourcentage de la surface de la colonie) pour quantifier la croissance cellulaire clonogénique. Guzmán et al. (2014) ont développé un plugin ImageJ librement disponible appelé ColonyArea qui fait exactement cela (voir figure 2b).7C’est un outil utile à utiliser si vous avez des colonies fusionnées qui sont difficiles à compter à l’œil ou par un logiciel de comptage de colonies ou si vous voulez une méthode d’analyse rapide et à haut débit.

Figure. 2 | Outils de mesure des essais clonogéniques librement disponibles. (A) Brzozowska et al. ont développé un logiciel (countPHICS) qui compte les colonies et mesure la taille des colonies.6 (B) Guzmán et al. ont développé un plugin ImageJ, ColonyArea, qui quantifie la zone de croissance des colonies et l’intensité de la coloration7.

Protocole de dosage clonogénique sans étiquette, sans point final et semi-automatisé

Un article récent de Mayr et al. (2018), décrit un nouveau protocole de dosage clonogénique modifié qui utilise un format de microplaque à 96 puits et une détection de confluence pour mesurer les colonies. Cette méthode permet des montages expérimentaux complets en utilisant une plaque à 96 puits, elle est sans étiquette, n’a pas de point final de coloration et l’analyse est semi-automatique (figure 3)8. En outre, la mesure de confluence résolue dans le temps et sans point final du même puits a montré que l’analyse semi-automatique était adaptée à la détermination du nombre de colonies et de leur taille moyenne.

Figure. 3 | Mayr et al. ont évalué la croissance clonogénique dans le format 96 puits au fil du temps en utilisant la détection de confluence8. Le graphique montre la quantification de la croissance clonogénique à différents points de temps et les images montrent les puits spécifiques avec la détection de confluence. Les taches vertes représentent les zones détectées par un lecteur de confluence et les flèches orange indiquent les colonies fusionnées.

Cette méthode de test clonogénique fournit une alternative efficace en termes de temps et de coût au protocole de test clonogénique standard. Ne nécessitant pas de fixation et de coloration du point final, ce protocole permet un suivi et une analyse continus de la croissance clonogénique. En outre, des mesures supplémentaires sur la cinétique de la croissance des colonies peuvent également être extraites pendant l’expérience. Le format miniaturisé offre également la possibilité de tester des traitements coûteux tels que les thérapies à base de siRNA ou de CRISPR/Cas9 qui ne seraient pas réalisables avec le volume de traitement requis pour une plaque à 6 ou 24 puits. En fin de compte, Mayr et al. ont démontré que la microscopie sans étiquette avec détection de confluence est une option robuste et viable pour mesurer la clonogénicité.

Une solution sans étiquette, sans point final et automatisée pour vos essais clonogéniques est le CytoSMART Omniavec son algorithme de détection des colonies. La formation de colonies est mesurée dans le temps sur l’ensemble d’un puits avec des lectures du nombre de colonies, de leur taille et de leur circularité. Vos cellules n’ont pas besoin de quitter l’incubateur et des informations cinétiques cellulaires pendant le processus de formation de colonies peuvent être obtenues (figure 4).

Figure 4 | Détection automatisée des colonies à l’aide du CytoSMART Omni. Des cellules cancéreuses du foie HEP-G2 dans une plaque à 24 puits ont été imagées pendant 75 heures à l’aide du CytoSMART Omni qui est maintenu à l’intérieur d’un incubateur standard à CO2. L’image montre un puits plein après l’exécution de l’algorithme de détection des colonies, avec des grappes de cellules mises en évidence par le masque orange des colonies. Le nombre de colonies, leur taille et leur circularité ont été mesurés pendant toute la durée de l’essai et sont indiqués dans les graphiques.

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